[发明专利]快速检测生物液体中的肝细胞生长因子的新方法

说明书

发明领域

本发明属于用于检测生物样品中的生长因子如肝细胞生长因子(HGF)存在的产品的技术领域。本发明还涉及实施这类方法的方法。

发明背景

肝细胞生长因子(HGF)是一种独特的生长因子，其与其他已知的多肽有丝分裂原不相关。其是在间充质细胞(如肺巨噬细胞和成纤维细胞)、肝脏中的库普弗(Kupffer)细胞，以及白细胞中表达的一种蛋白质。HGF响应细胞损伤而分泌并且似乎对于某些器官的再生和创伤愈合很重要。其为异二聚体，具有二硫键结合的分别为约60和30kDa的重链和轻链，其首先以非活性的前体形式合成。在受损伤的器官中，前体由特定的激活剂切割成活性蛋白。HGF以旁分泌形式起作用(即其影响相邻的细胞)，并以内分泌形式起作用(即，其具有长距离)。HGF的靶细胞是完全发育的上皮细胞。HGF在器官损伤的位点处以高浓度产生并存在。

已经研究了各种感染性疾病中HGF的全身和局部产生，并且在急性感染疾病(如胃肠炎、脓毒、肺炎、皮肤和软组织感染以及肾盂肾炎)中观察到了高血清HGF浓度。在增强的全身性产生HGF的同时，已在脑膜炎期间的脑脊液中发现高HGF浓度。肺炎患者的呼出气冷凝物中升高的HGF浓度(其与血清HGF水平无关)表明在肺炎期间局部产生HGF。此外，已经研究了血清中HGF的稳定性，并且已发现HGF在稀释的粪便样品中非常稳定，并且几次冻融循环、不同的缓冲液或在20℃下储存几年并不显著影响粪便HGF浓度。已显示腹泻期间粪便中高量的HGF可能表示患者患有可传染的胃肠炎。另外，已显示在感染性疾病中监测治疗前和治疗后的HGF水平有可能在早期揭示治疗失败。

对建议疗法之间的临床重要性和差异的识别、身体中炎性紊乱之间的不同诊断已经成为几类研究的目标。一个主要的临床问题是确定感染或其他炎性紊乱是否引起疾病。医生通常采用几种标志物来建立正确的诊断，如显微镜分析和体液的培养、白细胞计数、C-反应性蛋白、血浆原降钙素和乳酸盐。然而，仍然没有可使用的金标准。在治疗肠内炎症紊乱，溃疡，关节病，CNS病症，腹腔、胸腔和心包积水等时，在正确诊断的建立中每天都会产生问题。常规标记物(如CRP和WBC)的量可能在几种紊乱中很高，并且尽管存在感染，培养物并不总是阳性的。在PCT申请PCT/SE2001/001831中讨论了高量的HGF及其在感染性疾病的诊断和预后中的应用。但在这些研究中，通过ELISA方法来确定体液中HGF的总量。已经报道了各种关于HGF的研究。一些研究已经使用血浆/血清和尿中HGF的测定来诊断和筛选疾病，如急性肾功能缺陷、心肌梗塞、膀胱癌、急性胰腺炎和急性及慢性肺病。出于该原因，已经使用了之前描述的方法，如ELISA和Western印迹。在炎性病症期间检测到高量的细胞因子并不是唯一发现。然而，在一些情况中，已发现HGF的测定是灵敏的方法，其可以比常规方法更容易地检测到特定的临床问题(PCT申请PCT/SE2001/001831)。

之前描述的方法(如ELISA和Western印迹)基于样品中的HGF和特异性结合HGF的抗体之间的相互作用。在ELISA中，测定HGF单链和双链的量。通过Western-印迹，通过检测样品中存在的表观分子量来确定体液中HGF的质量。然而，该方法是繁琐且费力的。

生物传感器的创新应用在该分析领域中是有用、便宜并且快速的。可以使用表面等离子共振技术来检测粪便中的HGF(WO2005/031365)。该技术能够在单次运行中检测HGF水平和质量。

WO2010/151222描述了测定样品中生物活性或无活性HGF的存在与否或量的方法，包括将样品与包含胞外基质或细胞膜的HGF结合组分的凝胶接触，向凝胶添加甲苯胺蓝，和将凝胶和/或与该凝胶接触的液体的颜色与样品中生物活性HGF的存在与否或量相关联。

-在感染的情况中：在不同的器官中，在感染位点处HGF的水平局部增高。可以通过ELISA检测总蛋白量。使用Biacore技术，检测到单克隆、多克隆抗体与HGF以及固定于芯片上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的相互作用(信号)的水平较高，并且其与ELISA所得的结果正相关。