[发明专利]检测例如miRNA的特定核酸序列的免疫测定

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测生物样品中核酸的方法和试剂盒。

背景技术

最近，分子诊断已经受到越来越多的关注。分子诊断发现了进入疾病的临床诊断(特别是传染性病原体的检测、基因组突变的检测、病变细胞的检测和对疾病诱因的危险因子的识别)的入口。然而，与此同时亦已发现分子诊断方法在兽医学、环境分析和食品测试中的应用。

特别地，通过确定组织中的基因表达，核酸分析在疾病的研究和诊断方面开辟了新的极具前景的可能性。

为了压缩成本并且尽可能缩短从接受样品到确定分析结果的处理时间(也称作“结果时间”(“time to result”))，首要目标是使检测核酸的方法尽可能高效，和尽可能自动化地实施这些方法。这特别适用于诊断。那些能够在差异尽可能小的反应容器中并以标准化的形式(例如96孔的微量滴定板的模式)实施的方法因在这些方法中能够使用高效的移液机器(pipetting robots)而非常适用于自动化。因此，在现有技术的状态下，需要简单、高效且自动化的样品分析。

如今，通常通过例如异种杂交测定(heterogenous hybridization assays)、PCR法或直接测序法来检测或量化特异性核酸序列。这些类型的分析方法通常具有相当长的结果时间，这使得它们难以应用于危急的医疗情形，例如在发生心脏病的过程中。此外，现有测试不适用于免疫测定分析仪，其是临床实验室或者例如急症室的医护点装置(point-to-care settings)中的最杰出的平台。

待检测的目标核酸包括基因组DNA、表达mRNA和其它例如微RNA(MicroRNA)(简称miRNA)的RNA。miRNA是一类新的具有各种生物功能的小型RNA(A.Keller et al.,Nat Methods.20118(10):841-3)。它们是发现于真核细胞的短(平均为20～24个核苷酸)核糖核酸(RNA)分子。在哺乳动物中已经确定有数百种不同种类的微RNA(即数百个不同的序列)。它们对于后转录的基因调控来说是重要的，并且与靶信使RNA转录物(mRNAs)上的互补序列结合，这可导致翻译阻遏或靶退化(target degradation)和基因沉默。因此，也可将它们用作为研究、诊断和治疗目的而使用的生物标记。在现有技术中，还通过异种杂交测定或直接测序来检测或量化miRNA。由于miRNA本质上是化学不稳定的且是易于降解的，可信地量化miRNA尤其是一项挑战。这是由于RNA的化学不稳定性、miRNA以单链的核酸的形式存在的事实和它们长度短。

在不同的方法中，Quavit等人(Anal.Chem.,2011,83(15),pp5949-5956)使用涂覆有寡核酸的(oligo-nucleotide-coated)重量分析传感器与miRNA结合。所得到的杂交体与抗DNA:RNA抗体(anti DNA:RNA antibodies)结合，并且通过重量分析检测杂交体与结合有抗体的杂交体之间的质量差异。因为核酸探针是传感器的部件，并需要为每个目标靶核酸配置单独的传感器，所以这种方法对于目标靶核酸来说是不灵活的。

进一步的问题在于，在分子生物学研究和诊断方面的许多应用需要测定样品中特定核酸的含量和浓度。量化核酸所采用标准方法是借助于PCR反应、即使用已知浓度的内标，和/或使用实时PCR。但是，不利的是，这些方法具有有限的动态范围。该动态范围通常在1～100和1～1000之间。此外，由于污染的可能性和非线性的酶动力学，PCR法在量化上已经被视为是不可信的。

定义

除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。

本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段，所述片段能特异性结合抗原。适用于本发明的抗体(包括抗体片段)可为单克隆的、多克隆的、任何宿主生物源的、经重组表达或以其他方式人工制造的和任何免疫球蛋白类型的抗体。在本发明的上下文中，所述抗体能够和包括目标核酸分子和核酸探针的杂交体的抗原结合。

本文所使用的术语“杂交”是指使互补的单链核酸或核苷酸类似物结合成单一的双链分子、即所谓的“杂交体(hydrid)”的方法。通常条件下，核苷酸或核苷酸类似物会和它们的补体结合，因此两条互补的链会容易地相互结合。可使用单链的探针以便发现互补的靶序列。如果在样品中存在这样的序列，那么所述探针会与所述序列杂交，然后能够检测出该序列。