[发明专利]用于体细胞核重编程的先天免疫激活

说明书

政府权利

本发明是在政府支持下根据国家卫生研究所授予的合同HL100397和HL103400完成的。政府对本发明享有某些权利。

发明背景

Yamanaka和同事进行的开创性研究显示某些转录因子的异位表达可能会诱导体细胞的多能性。这些诱导性多能干细胞(iPSC)自我更新并且分化成多种细胞类型，从而使其成为用于疾病和患者特定性再生医学疗法的一种有吸引力的选择。它们已被用于成功地模型化人类疾病并且具有极大的用于药物筛选和患者特定性细胞疗法的潜能。此外，从患病细胞产生的iPSC可充当适用于研究疾病机制和潜在疗法的工具。然而，仍应对有关体细胞重编程为iPSC的潜在机制有更多了解，并且要关注在没有机制性深入理解的情况下的潜在临床应用。

用于重编程为多能细胞的因子(RF)组包括Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog。Oct3/4和Sox2是在胚胎干(ES)细胞中保持多能性的转录因子，而Klf4和c-Myc被认为是提高iPSC产生效率的转录因子。据信转录因子c-Myc修饰染色质结构以允许Oct3/4和Sox2较有效地接近为重编程所必需的基因，而Klf4通过Oct3/4和Sox2增强某些基因的激活。Nanog(像Oct3/4和Sox2一样)是在ES细胞中保持多能性的转录因子，而Lin28是被认为影响在分化期间特异性mRNA的转译或稳定性的mRNA结合蛋白。最近，已证实Oct3/4和Sox2的逆转录病毒表达与丙戊酸、染色质去稳定剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的共施用一起足以使成纤维细胞重编程为iPSC。

为从体细胞产生iPSC，已使用病毒载体或质粒来过表达这些重编程因子的一些组合。然而，这些方法产生低重编程效率并且未能提供对重编程过程的精确控制。此外，这些用于核重编程的方法固有地引起关于由DNA整合所引起的潜在致瘤性和基因沉默突变的担忧。因逆转录病毒感染造成的外来DNA整合到宿主基因组中引起对外来DNA可使必需基因沉默或诱导这些基因调节异常的担忧。虽然Cre-LoxP位点基因递送或PiggyBac转座子途径已用于在基因递送之后从宿主基因组上去除外来DNA，但没有一种策略消除诱变的危险，因为其留下小的残余外来DNA插入物。

作为基因修饰的替代方案，已产生用于无整合核重编程的细胞穿透蛋白(CPP)，其中重编程因子融合到为蛋白质膜运输到核中而提供的结构域中。已通过使用纯化重组蛋白在鼠胚胎成纤维细胞中实现成功重编程为多能细胞。尽管已使用来自胚胎干细胞(ESC)以及过表达四种转录因子的HEK293细胞的细胞提取物重编程人类细胞，但尚未使用纯化CPP重编程人类细胞。并且甚至在小鼠细胞情况下，使用CPP的重编程效率(约0.001％)比使用逆转录病毒载体实现的重编程效率(0.1％-1％)低大于10倍。

用于iPSC产生或转分化成不同体细胞类型的基于CPP和/或小分子的途径避免了关于外来DNA整合的所有担忧，并且提供对浓度、时间和因子刺激顺序的较大控制，然而此类方法在实际操作中仍存在重大问题。本发明解决了这个问题。

发明概述

提供用于使用非整合方法有效产生诱导性多能细胞或转分化细胞的组合物和方法。在本发明的方法中，需要重编程为多能细胞或转分化的体细胞与有效剂量的toll样受体(TLR)激动剂接触，所述TLR包括但不限于TLR3。接触步骤可在细胞与非整合重编程因子接触之前、与其同时或在其之后进行，通常同时进行。非整合重编程因子是核作用多肽或改变转录的小分子，并且其可诱导靶细胞重编程。在一些实施方案中，重编程因子是融合到多肽穿透结构域中的多肽，例如如本领域中已知的九精氨酸、tat等。在一些实施方案中，重编程因子是Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog中的一者或多者。

在一些实施方案中，提供重编程细胞群，其中初始体细胞群重编程为诱导性多能或转分化细胞群。此类细胞在本领域中已知的各种方法(包括药物筛选、自体或异体移植治疗性细胞施用等)中获得应用。重编程细胞群因不存在整合遗传因子而提供优势。