[发明专利]核酸的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的检测方法。

背景技术

各种生物的遗传信息分析的研究已经开始，关于以人类基因为首的大量基因及其碱基序列、还有由基因序列所编码的蛋白质和由这些蛋白质二次加工成的糖链的信息正在迅速被阐明。对于序列被阐明的基因、蛋白质、糖链等高分子体的功能，可以通过各种方法来调查。作为主要的方法，对于核酸，可以利用RNA印迹(northern bloting)、或者DNA印迹(southern bloting)这样的各种核酸/核酸间的互补性来调查各种基因与其生物体功能表达的关系。对于蛋白质，可以利用以蛋白质印迹(western bloting)为代表的蛋白质/蛋白质间的反应来调查蛋白质的功能和表达。

作为核酸检测方法之一，已知夹心杂交法。夹心杂交法使用被固定于过滤器上的捕捉探针。捕捉探针与目标核酸的第1部分互补。在一个阶段中，使结合于过滤器的捕捉探针暴露于应对于目标核酸序列进行调查的样品，进一步暴露于与目标核酸的第2部分互补的带有标记的检测探针，但前述的第2部分与第1探针所互补的目标部分不同(即，与它们不重复)(专利文献1、2、非专利文献1)。该方法解除了在过滤器上固定化样品所需的工夫，另外可以选择第1探针使其适合支持体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第4,486,539号

专利文献2：日本特开平7-75600号公报

专利文献3：日本特表平9-507121号公报

专利文献4：WO 99/47705

非专利文献

非专利文献1：Sinikka Parkkinen et al.,Journal of Medical Virology20:279-288(1986)

发明内容

发明要解决的课题

夹心杂交法一般在事先使用PCR法等核酸扩增技术将样本扩增之后进行检测。通过扩增目标核酸而检测灵敏度被增强，但另一方面，由于混入的杂质DNA也被扩增，因而不仅产生假阳性的担心，而且在同时检测多种基因时，需要相应于基因数的引物组，其品质管理需要大量的劳力。

另一方面，也研究了多种不通过PCR法扩增目标核酸而进行检测的方法。下工夫研究了使目标核酸与捕捉探针杂交后，以标记体或者标签序列为基础，收入大量的发光体、或者荧光体等的增感技术，但是需要特殊的酶和/或复杂的反应、或特殊的支持体(平面光波导等)和/或特殊的发光体(提供能够通过瞬时性激发发光来检测的信号的标识(专利文献4)。

本发明的目的是，提供即使在不使用核酸扩增和/或增感技术而通过夹心杂交来检测目标核酸的情况下，也能够高灵敏度地检测目标核酸的核酸的检测方法。

用于解决课题的方法

本申请发明者们进行了深入研究，结果发现，在夹心杂交中，通过使与目标核酸的不同区域分别杂交的多种检测探针同时杂交，即使不使用核酸扩增和/或增感技术也可以高灵敏度地检测目标核酸，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下(1)～(11)。

(1)目标核酸的检测方法，包括：

使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触，使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交，并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针杂交，由此介由所述捕捉探针和所述目标核酸或其片段化处理物而使所述多种检测探针结合于所述支持体的工序；和

检测结合于支持体的所述多种检测探针的工序。

(2)根据(1)所述的方法，所述使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触的工序如下依次进行：使所述目标核酸或其片段化处理物与多种检测探针杂交，接着使与所述多种检测探针杂交了的所述目标核酸或其片段化处理物与所述捕捉探针杂交。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物的核酸长度的众数在100个碱基～1500个碱基的范围。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的方法，在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为1500个碱基的范围内，使多种检测探针杂交。