[发明专利]减少1-＞2读框移位的方法

说明书

本发明属于重组多肽生产领域。本文报道了一种重组生产具有减少的副产物含量的多肽的方法，其中通过修饰在翻译或转录过程中减少移码(frameshift)的编码核酸实现副产物含量的减少。

发明背景

蛋白质在现今的医用组合中发挥重要作用。对于人的应用，每种药用物质必须满足不同的标准。为了保证生物药剂对人的安全性，尤其必须将会引起严重危害的核酸，病毒，和宿主细胞蛋白质移除。为了满足质量管理规格标准(regulatory specification)，一个或更多个纯化步骤必须按照制造工艺。

可以例如通过原核细胞(比如大肠杆菌)生产重组多肽。重组生产的多肽占原核细胞的多肽含量的大多数并且经常在原核细胞内沉积为不溶的聚集体，即为所谓的包涵体。为了分离重组多肽，必须将细胞破碎并且必须在从细胞碎片分离包涵体之后将包含在包涵体中的重组多肽溶解。对于增溶离液剂，使用比如脲或盐酸胍。为了切开二硫键，尤其在碱性条件下加入还原剂，比如二硫赤藓醇，二硫苏糖醇，或β-巯基乙醇。溶解聚集的多肽之后，必须将重组多肽的对于生物活性至关重要的球状结构重建。在该所谓的复性过程中，例如通过针对合适的缓冲液透析(缓慢)降低还原剂的浓度，其允许变性的多肽重折叠为其生物活性结构。复性后，纯化重组多肽到对于预期用途可接受的纯度。例如，对于作为治疗性蛋白质的使用，必须建立大于90％的纯度。

重组生产的多肽通常伴有来自生产细胞的核酸，内毒素，和/或多肽。除了宿主细胞来源的副产物，在粗制多肽制备物中还存在多肽来源的副产物。除了别的以外，可以存在研究的多肽的截短的变体。

在WO 95/25786中，报道了在细菌表达系统中生产人载脂蛋白A1。

发明概述

已经发现，编码二肽AR的寡核苷酸可以是在编码包含二肽AR的多肽的核酸的翻译或转录过程中1-＞2移码的点。由于移码的出现，产生具有不编码的氨基酸序列的无义多肽。

因此，已经发现，包含在编码更大多肽的核酸中的编码二肽AR的寡核苷酸应该选自寡核苷酸gca cgt(SEQ ID NO：03)，gcg cgt(SEQ ID NO：04)，和gcc cgt(SEQ ID NO：05)。已经发现，编码所述二肽AR的寡核苷酸中的第四个核苷酸不应该是‘a’。

如本文报道的一个方面是重组生产包含所述二肽AR(SEQ ID NO：06)的多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，

其中包含在编码所述多肽的核酸中的编码所述二肽AR的寡核苷酸在第四位具有核苷酸‘c’。

因此，作为一个方面，本文报道了，重组生产包含二肽AR(SEQ ID NO：06)的多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，

其中包含在所述多肽中的二肽AR由寡核苷酸gca cgt(SEQ ID NO：03)，或寡核苷酸gcg cgt(SEQ ID NO：04)，或寡核苷酸gcc cgt(SEQ IDNO：05)编码。

如本文报道的一个方面是在包含二肽AR(SEQ ID NO：06)的多肽的生产中减少由1-＞2移码导致的副产物形成的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，

其中编码包含在编码所述多肽的核酸中的二肽AR的寡核苷酸在第四位具有核苷酸‘c’。

因此，作为一个方面，本发明报道了在包含二肽AR(SEQ ID NO：06)的多肽的重组生产中减少由1-＞2移码导致的副产物形成的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，

其中包含在所述多肽中的二肽AR由寡核苷酸gca cgt(SEQ ID NO：03)，或寡核苷酸gcg cgt(SEQ ID NO：04)，或寡核苷酸gcc cgt(SEQ ID NO：05)编码。

在如之前报道的所有方面的一个实施方案中，所述二肽AR是所有二肽AR。