[发明专利]多焦结构化照明显微系统和方法

说明书

相关申请的交叉引用

这是一件PCT专利申请，要求提交于2012年2月23日的美国临时专利申请No.61/602,139的优先权，其整体通过引用并入此处。

技术领域

本申请涉及多焦结构化照明显微，尤其涉及多焦结构化照明显微系统以及用于产生由样本的多焦图案引起的多个多焦荧光发射的方法。

背景技术

经典的荧光显微在分辨率方面受到光的波长的限制，这称为“衍射极限”，当样本发射由显微镜检测的荧光时，在典型的激发和发射波长下的横向分辨率限制为大约200nm，轴向分辨率限制为大约500nm。共焦显微是一种光学成像技术，其用以通过使用点照明和空间针孔布置从厚于焦平面的标本消除离焦发射光，从而将光学分辨率提高超过衍射极限，因而通过要求紧密关闭针孔的方法以衍射极限1.41倍的分辨率来传输图像。不幸地是，关闭针孔会将从样本发射的光的信号水平降低到一定程度，导致该特定的超分辨率方法不实用。此外，共焦显微镜必须使来自显微镜的照明光束的激发与针孔/检测器完美地对准，因为未对准的针孔会引起正在检测的光信号降低和变弱，以及引起样本本身的轴向光学断层降低。这样，共焦显微镜的未对准会引起光信号的降低。

已经发现了用于共焦显微的分辨率增强的方法，该方法使用检测器阵列(诸如照相机图像中的像素)，其中阵列中的每个检测器产生独立的共焦图像。如果检测器阵列充分小，则每个形成的共焦图像能够等同于由具有紧闭针孔的共焦显微镜形成的类似的共焦图像，使得当共焦图像完全对准时实现了衍射极限显微镜的1.41倍的分辨率。此外，反卷积提供了图像分辨率的进一步的提高。但是，该检测器阵列布置会受到限制，因为在样本的整个二维平面中仅扫描单个激发点，这会限制能够扫描样本的速度以及对样本的荧光发射的后续检测。

另一类型显微称为结构化照明显微(SIM)，其以空间调制激发强度来照明样本，空间调制激发强度相对于样本平移和旋转于不同位置，在每次平移和旋转时获取宽视野图像。适当地处理原始图像形成了最终图像，最终图像具有的横向分辨率是常规宽视野显微的横向分辨率的两倍。虽然这种SIM系统生成了具有常规显微镜的2倍空间分辨率的图像，但是当产生最终图像时却牺牲了时间分辨率，因为需要时间来采集多个原始图像中的每个。SIM还可以用来抑制离焦模糊，公知为“光学断层”。但是，这种光学断层是以计算方式来执行的，并且会受到散粒(泊松)噪声。因而当背景荧光会引起该散粒噪声贡献超过焦点内信号时，SIM不适用于厚的或者高染色的样本。

这样，本领域中需要结构化照明显微系统，其产生用于每个高分辨率图像的样本的多焦激发图案，而不会牺牲扫描速度，并且对可能会干扰SIM图像的散粒噪声有抵抗力。

发明内容

在实施例中，显微系统可以包括：光源，用于发送单个光束；以及分束器，用于将单个光束分成形成多焦图案的多个光束。扫描器将形成多焦图案的多个光束扫描到样本上，使得样本生成由每个多焦图案引发的多个荧光发射。接着，聚焦部件限定了孔径，所述孔径构造为物理地阻挡由每个多焦图案引发的多个荧光发射的离焦荧光发射，以及允许焦点内荧光发射通过所述孔径。此外，缩放部件缩小由每个多焦图案引发的多个焦点内荧光发射，使得所述多个焦点内荧光发射中的每个被缩小预定因子，以产生由每个多焦图案引发的多个缩小的焦点内荧光发射。求和部件对所述多个缩小的焦点内荧光发射中的每个求和，以产生多个已求和的、缩小的焦点内荧光发射，所述多个已求和的、缩小的焦点内荧光发射形成所述多个已求和的、缩小的焦点内荧光发射的合成图像。