[发明专利]具有偶氮还原酶活性的微生物的体外检测

说明书

本发明涉及微生物领域。更具体地，其涉及检测样品中微生物的方法，包括检测所述微生物对偶氮化合物的还原的步骤。

通常，样品中微生物的检测包括将所述样品与反应培养基相接触并检测该反应培养基中变化(其是微生物存在的标志)的步骤。因此实施的微生物检测方法优选地应基本不依赖于在其中寻找到微生物的样品的性质，并应有高灵敏度。

当反应培养基是固体时，方法包括直接观察细胞或观察菌落的形成。

当需要将检测自动化时，复杂程度进一步增加。

第一种方法包括通过比浊法或浊度检测，即通过显示反应培养基的不透明度来观察反应培养基。

其他方法，通过自动化或非自动化生物化学途径，利用比色法或荧光检测法的检测。

可以通过pH指示物的方式来检测样品与包含碳水化合物，如葡萄糖的试剂之间的反应。

如专利EP 0 424 293 B1所报道，可以检测样品与还原或氧化还原的发色或荧光指示物之间的反应。

可以使用发色或荧光酶合成底物(综述见Orenga et al.，2009；J.Microbiol.Methods；79(2)：139-55)。这样的底物通常适合于特定的酶活性，并允许在临床、食品或环境样品中的定向微生物检测。

如专利EP 0 790 299 B1所报道，可以，特别是在反应培养基的容器是密封容器时，显示pH或CO₂浓度的变化。

根据该现有技术，目前的途径仍然在于寻找通用底物，和/或允许快速反应的底物，和/或可以与复杂样品如食品基质一起使用的底物，和/或允许检测难以检测的微生物的底物。在这方面，本发明涉及用于检测可存在于样品中的，具有偶氮还原酶活性的至少一种微生物的新方法，包括在于下列中的步骤：

·将样品与包含至少一种偶氮化合物的反应培养基相接触；

·孵育所述反应培养基；和

·检测所述至少一种微生物对偶氮化合物的还原，其表示所述微生物的存在。

偶氮化合物是含一个或多个R1-N＝N-R2型“偶氮”键的分子。其原本已知是用于纺织、塑料、化妆品和农产品工业中的染料。已经报道了微生物和哺乳动物酶系统降解偶氮化合物(Xu et al；Anaerobe，16：114-119)。人结肠细菌种类中偶氮还原酶活性的存在甚至已导致了含有带偶氮交联键的聚合物的前药的合成(Chourasia & Kain，2003；J.Pharm.Pharmacet.Sci：6(1)：33-66)。

含偶氮键的化合物也被描述为“淬灭剂”，即如专利申请WO 2005/049 849中，其改变培养基或荧光基团的荧光性质。其随后可以与生物分子如脂、核酸、肽、蛋白等结合。在这方面，偶氮衍生物被用于制备用来序列特定检测的寡核苷酸：非杂交的寡核苷酸为非荧光的；当其在其互补靶序列上杂交时，有荧光发射。

本申请人在本文中描述了，在体外诊断方法中，和在微生物控制方法中，例如在农产品，制药或化妆品工业或者在环境控制中，实施的偶氮化合物的新用途。

为了帮助本发明理解的目的给出下面的定义。

术语生物样品意为用作分析的小部分或少量的分离的种类(species)。这可以是得自抽取的生物液体的人或动物临床样品，或者得自任何类型食品的食品样品，药物或化妆品产品，或者来自生产或处理食品或药物或化妆品产品的环境的样品。因此，这种样品可以是液体或固体。以非限制的方式，可涉及全血、血清、血浆、尿或粪便的临床样品，收集自鼻、喉、皮肤、伤口或脑脊液的样品，食品、水、饮料如奶、果汁、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的样品，得自于期望用于动物的饲料的样品，特别是如得自动物或植物粉料(meal)的样品，或者表面或水控制样品。在食品来源样品的情况下，其也指食品基质。

该样品可以以非修饰的形式使用，或者根据本领域技术人员已知的方法，在分析之前可以经过富集、稀释、提取、浓缩或纯化类型的制备。