[实用新型]肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型涉及生物应用领域，特别涉及一种肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，适用于肺孢子菌肺炎临床检测。

背景技术

肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonm，PCP)是一种严重的致死性肺炎。不仅常见于艾滋病及其他各类先天或后天免疫机能受损者，而且与慢性阻塞性肺病、肺囊性纤维变以及间质性肺炎等危害严重的呼吸系统疾病的发生密切相关。随着艾滋病蔓延、免疫抑制剂的广泛应用、慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病的日趋增多，PCP在临床上逐步成为“常见病”，已经引起医学界广泛重视。PCP一旦发生，病情进展迅速，不经治疗几乎100％死亡。而早期及时的治疗，治愈率可达80%。因此，早期诊断和治疗对患者的预后极为重要。由于PCP的临床表现和体征不具特异性，必须依赖实验室的病原学检查进行诊断。然而，因孢子菌寄生部位的特殊性，使其病原学检测方法受到取材及阳性率低等方面的限制，缺乏临床适用性。聚合酶链反应（PCR）等基因检测技术被认为是诊断肺孢子菌感染的最有希望的方法之一。但是，经典的及一些改良的PCR方法因其对设备要求高，操作过程复杂等缺点，难以在临床诊断中广泛推广应用。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术，是近年来开发的一种新的核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的6个区域设计3对特异性引物，在一种特殊的链置换DNA聚合酶（BstDNA polymerase）的作用下发生DNA链的置换和环化，恒温水浴（65℃左右）30-60分钟即可完成109-1010拷贝的扩增。其最低敏感检测极限是10个拷贝，比PCR高几个数量级。而且，LAMP技术不像PCR和实时定量PCR那样需要昂贵的仪器，只需要普通水浴箱即可。因此，与其他检测方法相比，LAMP方法有扩增快速、结果易于观察、设备简单、敏感性和特异性高等优点，适于基层临床应用。目前，LAMP技术正在被广泛应用于某些疾病的流行病学调查以及某些热带病的检测、诊断中。在日本被卫生组织认可并开发利用LAMP的检测试剂盒有八种：检测SARS冠状病毒，结核分枝杆菌，肺炎支原体，军团菌，A型流感病毒，H1，H5流感病毒，人类乳头状瘤病毒等。但是，目前尚缺乏LAMP技术检测肺孢子菌感染的可靠技术和可供临床应用的检测试剂盒。

发明内容

本实用新型是克服现有技术不足，提供一种特异性强、敏感性高、快速、廉价并且操作简单的肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，为检测肺孢子菌肺炎提供了技术保证，也有望成为临床检测肺孢子菌肺炎的主要方式。

一种用于肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，其特征在于：包括甜菜碱试剂瓶、dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂瓶、荧光指示剂、荧光显色液、阳性对照品、阴性对照品、试剂盒壳体和试剂瓶固定块，甜菜碱试剂瓶、dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂瓶、荧光指示剂、荧光显色液、阳性对照品、阴性对照品固定在试剂瓶固定块上，试剂瓶固定块固定于试剂盒壳体内。

所述的试剂盒壳体形状为长方体或其他形状，所使用的材料为纸板或其他材料，其打开方式为绕转轴打开，或其它打开形式，其闭合后固定方式为搭扣形式，或其它固定形式。

所述的试剂瓶固定块所能固定试剂瓶数量等于或者大于1，形状为长方体，或是其它形状，所使用的材料为海绵，或使用其它材料，固定试剂瓶的方式为依靠摩擦力固定，或其它固定方式。

肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒的使用方法包括如下使用步骤：

1）配置反应体系。从试剂盒中取出甜菜碱试剂瓶、dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂瓶，将溶液加入反应容器内，在反应容器内加入荧光指示剂、荧光显色液，将被检测模板加入反应容器；

2）LAMP扩增反应。将反应容器置于一定温度环境内反应一段时间；

3）结果检测。使用仪器检测反应扩增曲线（步骤1中使用荧光指示剂），或观察容器内颜色变化（步骤1中使用荧光显色液）判断检测结果；

4）阳性对照品、阴性对照品使用时，替代步骤1中的被检测模板。

本实用新型通过比较人源肺孢子菌(P.jirovecii)和大鼠源肺孢子菌(P.carinii、P.wakefieldiae)的核酸序列，选取核糖体小亚基一段保守序列，根据此序列设计特异性引物：

F3    5，-ATCAGATACCGTCGTAGTCTTA-3，