[发明专利]一种构建组织工程角膜内皮的方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程材料领域，具体涉及一种构建组织工程角膜内皮的方法

背景技术

羊膜是人胎盘的最内层膜，具有来源丰富、透明度高、通透性好、不含HLA-A、B、C及DR等抗原成分等优点；羊膜的组织结构包括单层羊膜上皮细胞层，基底膜层，以及基质层。羊膜上皮细胞形状规则且排列紧密，具有良好的物质交换功能。一张成熟的羊膜面积可达0.2平方米，聚集了3亿个羊膜上皮细胞。

角膜内皮由一层六角形内皮细胞所形成，厚约5微米，宽18-20微米，直接与房水接触，人体内这层细胞损伤后无法再生。角膜内皮细胞的屏障和主动液泵功能对于角膜保持正常厚度和透明性是极其重要的。目前，很多因素均可损伤角膜内皮，如白内障手术，高眼压，药物毒性，炎症等。一旦角膜内皮细胞密度低于维持内皮细胞生理功能的临界密度（400－700/mm2），即可发生角膜内皮失代偿，角膜将出现不可逆的病理性改变，导致患者视力下降甚至失明。

针对各种原因引起的角膜内皮细胞病变，可以通过单纯移植内皮的方法进行治疗，目前临床上常用的方法包括带后弹力层的角膜内皮移植以及带板层角膜的内皮细胞移植，但是这两种手术方式均需要从健康供体取得角膜组织。我国角膜移植供体紧缺，通过组织工程技术构建组织工程角膜内皮成为目前研究的热点。人的角膜内皮本身增殖能力很差，且供体稀少，因此采用人角膜内皮细胞构建组织工程角膜内皮的可行性较低。人羊膜上皮细胞具有与角膜内皮细胞相似的形态和功能特点，可以用来构建具有活性的组织工程角膜内皮。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建组织工程角膜内皮的方法。

本发明的具体技术方案如下：

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

（1）分离获取活羊膜上皮片；

（2）用上述活羊膜上皮片构建组织工程角膜内皮。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1）具体包括：

a、将带有绒毛膜的羊膜从新鲜胎盘上剪下，用HBSS漂洗以去除血迹；

b、撕除绒毛膜，用HBSS漂洗至无血渍，呈光滑透明状，得活羊膜；

c、将活羊膜的基质去除，或将活羊膜的基底膜和基质均去除，即得所述活羊膜上皮片。

在本发明的一个优选实施方案中，所述将活羊膜的基质去除的方法如下：将所述活羊膜置于含II型或IV型胶原酶的细胞培养液中，37℃消化1～6小时，然后在显微镜下分离除去被消化的基质。

在本发明的一个优选实施方案中，所述活羊膜的基底膜和基质均去除的方法如下：将所述活羊膜置于含Dispase酶的细胞培养液中，4℃消化0.5～4小时，然后在显微镜下分离除去基质及基底膜。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2）具体为：将所得活羊膜上皮片通过生物粘结方法或组织培养法附于生物材料载体膜上，制得所述组织工程角膜内皮。

在本发明的一个优选实施方案中，所述生物材料载体膜为供体角膜后弹力层、供体角膜基质、I型胶原膜或Hydrogel膜

在本发明的一个优选实施方案中，还包括步骤（3）：将所制得的组织工程角膜内皮放入保存液中进行保存。

在本发明的一个优选实施方案中，所述保存液为包括2.5%硫酸软骨素、5%右旋糖苷、1%庆大霉素和2%胎牛血清的MEM培养基。

在本发明的一个优选实施方案中，所述保存的氧浓度为1%～20%，温度为4℃至37℃。

本发明的有益效果是：

1、本发明所述的活羊膜上皮片细胞形状，组织结构，生物功能等均与角膜内皮相似，采用活羊膜上皮片可替代功能障碍的角膜内皮，维持角膜的正常功能，改善角膜内皮功能障碍引起的角膜水肿。

2、本发明的方法所用的活羊膜上皮片来源丰富，一张成熟的羊膜面积可达0.2平方米，聚集了3亿个羊膜上皮细胞。

3、羊膜中不含HLA-A、B、C及DR等抗原成分等优点可减少移植后的排斥应。

4、用本发明的所获取活羊膜上皮片可替代功能障碍的角膜内皮

5、用本发明的方法所获取的活羊膜上皮片的细胞间连接紧密，易于移植。

6、用本发明的方法活羊膜上皮片可以供体角膜紧密粘合，不易脱落。

7、本发明的所构建的组织工程角膜内皮通过一定的处理，可保存，运输，作为组织工程产品广泛应用。

附图说明

图1为本发明实施例1所构建的组织工程角膜内皮的扫描电镜照片；

图2为本发明实施例1所构建的组织工程角膜内皮的LIVE/DEAD染色照片。