[发明专利]化学合成肺炎链球菌表面粘附素A的基因片段及表达、应用

说明书

技术领域

本发明化学合成肺炎链球菌表面粘附素A的基因片段及表达、应用涉及的是一种通过化学合成肺炎链球菌表面粘附素A(PsaA蛋白)的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位肺炎链球菌PsaA蛋白的片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测及单克隆抗体的制备等，本发明涉及基因工程技术和检测试剂领域。 

背景技术

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）简称肺炎球菌（pneumococcus）。为革兰染色阳性菌。肺炎链球菌会导致不同种类的疾病，包括有急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心囊炎、蜂窝组织炎及脑脓肿。 

目前针对肺炎链球菌感染的主要检测方法有：细菌学分离法，酶联免疫法(ELISA) ，DNA探针及PCR技术等。但这些方法或多或少都存在着实验时间长，不适合现场快速检测等缺点。近年来，免疫金标层析技术在生物医学各领域得到了广泛的应用，为肺炎链球菌的检测提供了新的思路。筛选肺炎链球菌外膜特异性抗原，并制备高纯度的特异性抗原，是建立该技术的重要前提。 

 肺炎链球菌表面粘附素A(PsaA)是各型Sp共有的一种遗传保守，种特异性的表面结合脂蛋白，与细菌的侵袭性和毒力有关。PsaA蛋白位于细胞膜表面，被紧密的荚膜层包裹着。PsaA在基因序列和所编码蛋白序列上具有高度的保守性。PsaA抗原决定簇全部或部分暴露于细胞表面，具有很好的抗原性，机体感染Sp后会产生抗PsaA特异性抗体。因此，该蛋白有可能作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的抗原，同时还有可能用于检测患者血清中相应的抗体，为肺炎链球菌感染的快速诊断提供依据。PsaA编码开放阅读框为930bp，分子量约为37kDa。 

发明内容

本发明通过化学合成的截短的PsaA蛋白的全新基因片段，利用基因工程技术，制备PsaA蛋白高表达片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的PsaA蛋白胞外区片段,第84个氨基酸 - 第280个 氨基酸，共197个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测或单克隆细胞株的制备。 

化学合成肺炎链球菌表面粘附素A的基因片段及表达、应用是采取以下步骤实现的：

1．PsaA蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析的氨基酸序列， 发现PsaA蛋白含有较强的抗原决定簇，选择第84个氨基酸－第280个 氨基酸作为研究对象。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子（TAA）和EcoRI酶切位点（下划线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。

筛选的PsaA蛋白片段氨基酸序列（第84个aa － 第280个aa）： 

化学合成的PsaA基因片段的DNA 序列（606 bp）：