[发明专利]一种在昆虫细胞sf9中表达hABCC2的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在昆虫细胞sf9中表达hABCC2的方法，属于生物基因工程领域。

背景技术

ABCC2是ABC七大家族转运体中C族的蛋白成员之一，在人的正常细胞和肿瘤组织中均有表达，如小肠上皮顶膜、胎盘合胞体滋养层、肠小管膜、大脑微血管皮细胞、乳腺小叶、和乳腺癌细胞等。ABC蛋白的主要功能是小分子物质及多肽分子跨膜转运。转运膜区会通过改变形态允许某些分子通过。免疫组化显示ABCC2主要在细胞膜和胞浆中表达，不仅具有吸收、分泌和排泄功能，而且具有抑制消化道吸收某些外源性物质，参与形成血脑、胎血屏障等生理功能；同时ABCC2是ATP结合转运蛋白，需要结合水解胞浆中的ATP，以此确保转运底物所需的足够能量，该蛋白及转运膜区的这些特殊反应能够使转运子与底物像齿轮一样吻合并通过水解ATP来转运底物。此外，ABCC2也是与肿瘤多药耐药有关的新的药物排出泵，是肿瘤多药耐药的重要机制之一。因此，对ABCC2的抑制剂或底物的研究具有重要意义。目前尚未有在昆虫细胞中表达hABCC2的相关方法报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种在昆虫细胞sf9中表达hABCC2的方法，通过该方法制得的hABCC2可用于hABCC2底物或抑制剂的检测。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种在昆虫细胞sf9中表达人hABCC2的方法，包括如下步骤:

步骤一，人工合成两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的hABCC2基因；

步骤二，将hABCC2基因克隆入pFastBac1载体的BamHI/HindIII位点，得到重组质粒pFastBac1-hABCC2；

步骤三，将重组质粒pFastBac1-hABCC2转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入hABCC2基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCC2；

步骤四，脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCC2转染sf9昆虫细胞，获高滴度的hABCC2的重组病毒；

步骤五，hABCC2的重组病毒感染SF9昆虫细胞，大量表达hABCC2蛋白。

本发明进一步地，步骤一所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的人hABCC2基因通过如下方法获得：根据NCBI参考序列信息NM_000392.3，在5‘端添加BamHI酶切位点序列，在3’端添加HindIII酶切位点序列，序列总长度为4850bp 。

本发明进一步地，还包含对所述重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCC2的PCR鉴定方法，步骤如下：分别以T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-pFast R:(SEQ ID No.2)、T-hABCC2 F:(SEQ ID No.3)和T-hABCC2 R:(SEQ ID No.4)、或/和T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-hABCC2 R:(SEQ ID No.4)为引物组合对SF9-hABCC2基因组DNA进行PCR扩增，扩增出对应的5166bp、418bp、873bp目标片段，即为hABCC2基因在SF9昆虫细胞中表达完成。

本发明进一步地，还包括重组hABCC2蛋白功能的鉴定方法，步骤如下：将ABCC2蛋白的转运底物加入表达ABCC2蛋白的细胞膜中，参与ATP/AMP反应，反应终止后将细胞膜中微囊泡外的转运底物洗去，通过液质联用、荧光测定法或同位素标记底物法中的一种来测定微囊泡内的转运底物浓度，从而判定ABCC2蛋白的活性。

本发明进一步地，所述微囊泡内的转运底物浓度越大，ABCC2的活性越高。

本发明进一步地，所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的昆虫细胞培养基。

本发明的应用和实施使其显著技术效果为： 

①参照序列合成了hABCC2基因，进而将其克隆入pFastBac1载体，并进一步获得含hABCC2基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCC2，通过脂质体介导转染sf9昆虫细胞，成功实现了hABCC2基因在昆虫细胞中的表达，为hABCC2的大量获得提供一条新途径，为人ABCC2蛋白的应用开发打下工作基础； 

②通过本发明方法可获得高滴度的重组的杆状病毒，进而直接感染昆虫细胞，有利于大规模生产其外源蛋白；

③利用本发明方法制得的重组人hABCC2蛋白制作成药物体外测试试剂盒，可实现hABCC2蛋白底物或抑制剂药物体外吸收测试的全自动高通量筛选，与现有体外细胞ABCC2模型测试方法相比，灵活性更高、重复性更好。