[发明专利]一种新的重组人生长激素粗提中的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术，具体涉及重组人生长激素粗提取。

背景技术

生长激素能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖类及脂肪的代谢，对人体新陈代谢等各种生理功能有广泛的调节功能。现有技术中重组人生长激素粗提过程包括用由TPS-Hgh为菌体（以大肠杆菌做载体，通过基因工程的技术构建，中国专利：20120580558.2)，经Tris-EDTA缓冲液（TE）在磁力搅拌器上搅拌裂解，离心，收集离心上清液。在上清液中加入梯度硫酸铵和梯度氯化钠，用玻璃棒搅拌至完全溶解，盐析，离心，收集离心沉淀。离心沉淀使用裂解缓冲液进行溶解，溶解后离心，收集上清样品，其后，再进入精提取步骤。现有的提取方法中目标蛋白收率较低，而且杂质较多。破菌比例大，浪费原材料，在实际生产中造成成本增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的重组人生长激素粗提中的取方法，用于重组人生长激素的粗提阶段，克服现有的粗提过程存在的上述不足。

本发明的方法包括以下步骤：

1、制备破菌缓冲体系：配制20mM磷酸盐缓冲液（PB）,盐酸调节pH至7.5-8.0，缓冲液成分为：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA、纯化水，用量比列是5.732g:0.624g:0.292g：1000ml；

2、菌体称定：等量称量2份TPS-Hgh工程菌菌体备用；

3、菌体裂解：将步骤2所取菌体按菌体：缓冲体系为1:6，放在磁力搅拌器上裂解1h至菌体完全溶解；

4、裂解液离心：将步骤3所得裂解液等量称量后，对称放入离心机转子腔内，在转数6900rpm/min，温度4-8℃条件下离心30min，收集离心上清液；

5、上清液盐析：在步骤4所得上清液中加入梯度硫酸铵，硫酸铵和上清液的体积比是243g、277g、313g、351g、390g、430g、472g/1000ml和氯化钠和上清蛋白盐析液的体积比分别是233g、263g、292g、321g、351g/1000ml，用玻璃棒搅拌至完全溶解，盐析30min，再次离心，参数同上。收集离心沉淀。

6、沉淀溶解：离心沉淀使用20mMPB裂解缓冲液溶解，溶解后对称放入离心机转子腔内，在转数6900rpm/min，温度4-8℃条件下离心30min，得含蛋白的上清液,完成粗提，

本发明的积极效果是：用本发明破菌缓冲体系裂解冻融菌体，能够使在大肠杆菌菌体中的重组尿酸氧化酶通过破菌缓冲体系的压差释放量更高，可获得较高的重组人生长激素产量，比10mMTE缓冲体系的蛋白收率高20%-30%，该方法经济、高效、容易操作，利于工业规模的生产。

图1本发明所得粗提物不同梯度硫酸铵盐析SDS-PAGE凝胶电泳图。

图2.本发明所得粗提物硫酸铵和氯化钠盐析SDS-PAGE凝胶电泳图。

图3.本发明所得粗提物和现有技术TE缓冲体系所得粗提物硫酸铵盐析SDS-PAGE凝胶电泳图。

具体实施方式

1、制备破菌缓冲体系：配制20mM磷酸盐缓冲液（PB）,盐酸调节pH至7.5-8.0，缓冲液成分为：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA、纯化水，用量比列是5.732g:0.624g:0.292g：1000ml；

2、菌体称定：等量称量2份TPS-Hgh工程菌菌体备用；

3、菌体裂解：将步骤2所取菌体按菌体：缓冲体系为1:6，放在磁力搅拌器上裂解1h至菌体完全溶解；

4、裂解液离心：将步骤3所得裂解液等量称量后，对称放入离心机转子腔内，在转数6900rpm/min，温度4-8℃条件下离心30min，收集离心上清液；

5、上清液盐析：在步骤4所得上清液中加入梯度硫酸铵，硫酸铵和上清蛋白盐析液的体积比是243g、277g、313g、351g、390g、430g、472g/1000ml和氯化钠和上清蛋白盐析液的体积比分别是233g、263g、292g、321g、351g/1000ml，用玻璃棒搅拌至完全溶解，盐析30min，再次离心，参数同上。收集离心沉淀。

6、沉淀溶解：离心沉淀使用20mMPB裂解缓冲液溶解，溶解后对称放入离心机转子腔内，在转数6900rpm/min，温度4-8℃条件下离心30min，得含蛋白的上清液,得粗提物。

本发明实施例所得粗提物相关检测