[发明专利]高密度发酵生产聚苹果酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种高密度发酵生产聚苹果酸的方法，特别涉及一种两阶段调控pH和溶氧来生产聚苹果酸的方法。

背景技术

现在，大部分合成高分子是石油化学产品，对环境产生了深远的影响。而随着人们环境保护知识的积累，引起了传统的不可降解高分子生产的改变。目前，人们关注的重点是环境友好型的生物可降解高分子，这些高分子聚合物的生产有利于节约能源和资源，从而减缓温室效应，发展生态协调的工艺过程和产品。

聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯，Poly malic acid或Poly malate,简称为PMLA）是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物。苹果酸是一种含有羟基的二羧酸，它是一种很好的食品添加剂，其水溶解性很强,在体内主要参与三羧酸(TCA)循环。聚合时通过其羟基和羧基酯化连接而成为高分子化合物。苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有三种，即α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人体内的只有β型PMLA（结构如下图）。

图2聚L-β–苹果酸的立体结构

聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯）属于聚酯类聚合物，是完全生物降解高分子。生物降解性材料是指通过自然界微生物（细菌、真菌等）作用而发生降解的高分子物质。该种材料降解的产物无毒无害,不会对环境产生二次污染,近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。在国外，有关聚苹果酸的研究开始于上世纪60年代，对于其性质、用途、合成方法都有一定的研究和报道，聚苹果酸主要应用于药物载体和微胶囊材料，其合成方法主要集中于化学合成，β型聚苹果酸已有商业产品。而国内还刚刚起步，对聚苹果酸的研究非常少，几乎为空白。因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究的平台，具有重要的理论价值和应用价值。

关于聚苹果酸发酵，文献中大多都是通过菌种诱变、培养基优化来提高聚苹果酸产量，很少提到通过控制发酵条件来调控提高聚苹果酸产量，只有在公开号为CN101696434A的发明专利中公开了一种微生物发酵法生产β-聚苹果酸的新工艺，文中提到发酵过程中要控制通风量、罐压、搅拌速率及溶解氧浓度，因此，寻求一种新的方法，来进一步提高聚苹果酸的产量，是当前要解决的重大问题。

发明内容

为解决上述现有技术中聚苹果酸产量的问题，本发明通过两阶段调控pH和溶氧，实现高密度发酵，以提高聚苹果酸的产量。

本发明所述高密度发酵生产聚苹果酸的方法，通过两阶段调控pH和溶氧，第一阶段使菌体大量生长；第二阶段改变pH和溶氧，使聚苹果酸大量合成积累。

具体包括如下步骤：

（1）将出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC.NO.3336菌株进行活化6-8h，将其从蔗糖斜面培养基转接到500ml的挡板瓶中，装液量为50ml，25℃恒温,200r/min培养72h，制得种子液；

所述种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K₂CO₃0.4g/L、MgSO₄·7H₂O0.1g/L、KH₂PO₄1g/L、ZnSO₄·7H₂O0.05g/L，其余为水，pH7.0。

（2）将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD₆₀₀值对pH和溶氧进行调控：

第一阶段发酵：当菌体OD₆₀₀＜0.7（种子干重小于15g/L）时，将溶氧降至55—65%，与搅拌串联，使溶氧维持至50-60%之间，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.0-7.0，促进菌体大量生长；

第二阶段发酵：当菌体OD₆₀₀≥0.7（种子干重大于或等于15g/L）时，将溶氧降至30-35%之间，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至4.8-5.2之间，发酵96-120小时，促进菌体大量合成聚苹果酸；

所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L；

（3）每隔8小时取样记录测定各项指标：pH、溶氧、菌体干重、发酵液残糖、聚苹果酸产量。