[发明专利]基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株

说明书

技术领域

本发明涉及微生物密度感应机制研究领域，更具体地讲，涉及基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株及其构建。 

背景技术

生物膜是自然界中大多数微生物的存在形式，其形成可大大增强微生物的生存能力及抵抗来自环境、宿主和抗菌药物的能力，因此生物膜形成成为许多慢性顽固性感染疾病的主要发病因素。密度感应在生物膜的形成、发展和成熟中发挥重要作用。密度感应(quorum sensing,QS)是细菌的一种群体交流机制，即细菌通过合成、分泌并感知环境中的信号分子，以调节自身某些基因的表达。在已知的多种信号分子中，自诱导分子-2（autoinducer-2，AI-2）因其产生基因luxS保守存在于不同细菌中而其被认为参与了菌种间的信号传递。通过敲除luxS基因，许多研究表明LuxS/介导的密度感应缺陷会导致细菌许多生理表现损伤，包括生物膜形成障碍。但实质上，AI-2是细菌甲基循环（AMC）过程中的一种副产物（甲基循环过程见附图1），由其产生过程可知，LuxS同时催化AI-2和HCY的生成，因此，LuxS缺失不仅会导致AI-2介导的密度感应缺陷，同时会导致AMC通路障碍。因此，由LuxS缺失导致的功能障碍也有可能是由AMC障碍引起的。显然，LuxS缺失的密度感应和代谢双重缺陷效应，使得LuxS调控机制的研究变得困难，由此，在LuxS调控机制探讨中，密度感应和AMC代谢通路的分离变得至关重要。 

变异链球菌是已知的主要致龋菌之一，而生物膜即牙菌斑形成和耐酸性是其两大重要致龋因素。研究表明LuxS缺失会导致变异链球菌的许多生理障碍，包括许多龋病发生相关的致病特性变化。而在障碍发生机制的研究中，同样存在密度感应和代谢调控的争议。过去普遍认为LuxS/AI-2介导的密度感应机制在这些生理变化中发挥主要作用。但近年来，许多研究通过加入外源AI-2的方法，发现LuxS缺失导致的许多基因转录变化或生理特性改变并未得到恢复。由此LuxS/AI-2介导的密度感应在LuxS调控功能中的影响逐渐被削弱。显然，作为LuxS调控功能的另一贡献成员，代谢通路在变异链球菌LuxS相关生理特性中的调控作用值得重视。 

在一些缺乏luxS基因的细菌如绿脓杆菌中，AMC的完成主要依靠SahH完成。SahH直接催化SAH生成HCY而不会产生副产物DPD，因此为密度感应和代谢的分离提供有利工具。SahH恢复代谢的能力已被研究证明（Sylvio Redanz, Kerstin Standar, Andreas Podbielski, and Bernd Kreikemeyer. Heterologous Expression of Heterologous Expression of sahH Reveals That Biofilm Formation Is Autoinducer-2-independent in Streptococcus sanguinis but Is Associated with an Intact Activated Methionine Cycle [J]. J Biol Chem. 2012 October 19; 287(43): 36111–36122.），以此为基础，我们以变异链球菌LuxS缺陷株为模型，利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达载体引入外源SahH，构建了变异链球菌密度感应缺陷背景下的代谢恢复株，实现了代谢与密度感应的分离。为今后LuxS对变链菌功能调控机制的深入研究提供研究工具。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，从而实现LuxS介导的代谢途径与密度感应途径的分离。 

本发明的第二个目的在于提供基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法。 

为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，其特征在于，所述AMC代谢恢复株为Streptococcus mutans KO-S UA159：：△luxS, pIB-sahH，保藏编号为CCTCC M 2013699。 

为实现以上第二个目的，一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达质粒pIB169，通过酶切、连接，将体外PCR扩增出的sahH和luxS基因片段连接到载体上，构建出大肠杆菌-变异链球菌SahH蛋白的穿梭表达质粒及作为阳性表达对照的LuxS蛋白表达质粒；