[发明专利]一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法

权利要求书

1.一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）诱导形成胚性愈伤组织；   

（b）建立胚性细胞悬浮培养系，获得直径大于0.7毫米的胚性细胞团；

（c）利用步骤（b）获得的胚性细胞团再生植株，其中所述建立胚性细胞悬浮培养系包括如下步骤：

（b1）破碎所述胚性愈伤组织获得直径不超过0.7毫米的胚性细胞团；

（b2）将0.2~1.0克的胚性细胞团接种于20mL悬浮培养基中，在温度25~27℃，光照800~1000 lux，90~110转/分钟震荡培养，其中所述悬浮培养基以MS培养基为基本培养基，每1升基本培养基中添加0.5~1.0毫克的噻苯隆、1.0~3.0毫克的2,4-D、20~40克的蔗糖，pH值为5.6~6.0；

（b3）6~8天继代一次，继代时将增殖的胚性细胞团破碎，将0.1~0.2克的胚性细胞团转移至新鲜的悬浮培养基的中，按相同条件继续培养，3~4周后，获得大量胚性细胞团。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b2）中所述每1升基本培养基中添加1.0毫克的噻苯隆、1.0毫克的2,4-D、20~40克的蔗糖，pH值为5.6~6.0。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b2）中所述胚性细胞团的接种量为0.2g/20mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）包括：

（a1）取葱莲的幼嫩花梗，经表面消毒处理，将幼嫩花梗切成1~3厘米长的片段，接种于胚性诱导培养基中；

（a2）在温度25~27℃的黑暗环境中培养12~16周，获得亮黄色的松散易碎的胚性愈伤组织。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（a1）所述的胚性诱导培养基为以MS培养基为基本培养基，同时还含有0.5 毫克/升的TDZ、1.0 毫克/升的2,4-D、20~40 克/升的蔗糖和8克琼脂，pH值为5.6~6.0。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（c）包括：

（c1）将获得的直径大于0.7毫米的细胞团接种至分化培养基中；

（c2）在温度25~27℃、光照强度为1000~1400 lux，每日10~14小时光照环境中培养8~10周后，经体细胞胚发生途径再生获得小植株。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（c1）所述分化培养基以MS培养基为基本培养基，每1升基本培养基添加0.1~1.0毫克的ABA和20~40克的蔗糖，pH值为5.6~6.0。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述每1升基本培养基添加0.5毫克的ABA。