[发明专利]一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述检测探针包括发卡探针、引物-1和引物-2，所述发卡探针依次包括茎-1、环以及茎-2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA（1），所述双链DNA（1）具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2～8bp；

所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补。

2.如权利要求1所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述发卡探针的双链DNA（1）具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列中，所述甲基化酶为Dam甲基化酶或M.Sss Ⅰ甲基化酶，所述依赖甲基化的内切酶为Dpn Ⅰ内切酶。

3.如权利要求1所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述引物-1中，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～5所示的核苷酸序列；所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻内切酶为Nb.Bsm Ⅰ切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、或Nt.BstNBI切刻内切酶。

4.如权利要求1所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述引物-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

5.一种基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，包括：

发卡探针、引物-1、引物-2、发卡探针甲基化试剂、依赖甲基化的内切酶酶切试剂、环形探针连接试剂、滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂、DNA酶检测试剂，

其中，所述依赖甲基化的内切酶酶切试剂包括依赖甲基化的内切酶，所述环形探针连接试剂包括DNA连接酶和DNA外切酶，所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂包括DNA聚合酶和切刻内切酶，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；

所述发卡探针依次包括茎-1、环以及茎-2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA（1），所述双链DNA（1）具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2～8bp；

所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补。

6.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述发卡探针的双链DNA（1）具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列中，所述甲基化酶为Dam甲基化酶或M.Sss Ⅰ甲基化酶，所述依赖甲基化的内切酶为Dpn Ⅰ内切酶。

7.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述引物-1中，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～5所示的核苷酸序列；所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻内切酶为Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.Bsm Ⅰ切刻内切酶或Nt.BstNBI切刻内切酶。

8.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述引物-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

9.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括3-氨基邻苯二甲酰肼、硝酸双-N-甲基吖啶翁、2,4,5-三苯基咪唑、3,4,5-三羟基苯甲酸、双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐或2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)。