[发明专利]一种高效制备伊枯草菌素A及其同系物的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高效制备伊枯草菌素A（Iturin A）及其同系物的方法。

背景技术

伊枯草菌素A(Iturin A）及其同系物，主要来源于芽孢杆菌属（Bacillus）菌株例如枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis）的次生代谢产物，具有广谱抗病性和不易产生抗药性等优点，被认为是一种天然的、具有高效抑制植物和动物病原菌的抗菌物质。尤其Iturin A具有强烈的抗真菌特性，也抑制部分细菌的活性。

通常芽孢杆菌属（Bacillus）菌株例如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）产生两类次生代谢产物，一类是具有生物表面活性剂功能的生物表面活性素（Surfactin）,另一类是抗真菌活性的伊枯草菌素A（Iturin A）及其同系物。

伊枯草菌素类物质是多种同系物组成的混合物，其中主要成分为Iturin A，基本结构(见附图1)是一个由7个α-氨基酸组成的环肽，在N-末端为β-氨基脂肪酸。其侧链上的脂链基团的大小差别，构成了其同系物。

Iturin A的结构与活性密切相关，其侧链上的脂链基团越大（n值越大），活性越强；它的抗真菌活性还与目标细胞的细胞膜有关，它通过在细胞膜上形成离子通道，提高细胞膜的通透性从而作用于靶位点。医学上也用天然的Iturin A在一些人和动物的皮肤真菌感染方面做临床实验。由于它的广谱抗真菌性以及低毒和低变态反应性，使其很有希望成为一种高价值的抗真菌药物。

然而，迄今为止，国内外均没有高效的伊枯草菌素A及其同系物的生产方法。尤其是利用芽孢杆菌属（Bacillus）菌株例如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）发酵生产伊枯草菌素A及其同系物的技术没有突破，其产量低、成本高，发酵 工艺控制难度较大，制约着其工业化生产和商业化应用。

从近几十年来国内外的报道看,伊枯草菌素A及其同系物的发酵工艺研究历程主要分三个阶段,第一阶段（1995年以前）是传统的液体深层发酵（submerged fermentation,SMF）,主要集中在探索发酵条件对生物量和产量的影响。Sandrin等人（1990）用枯草芽孢杆菌S499进行摇瓶培养生产伊枯草菌素A和surfactin，其最高产量分别为280mg/liter（培养72h时）和760mg/liter。Shoda等人(1991,1993)用枯草芽孢杆菌NB22进行小型罐液体发酵，通过改变发酵过程中温度和通气量来控制伊枯草菌素的产量，最高产量达到620mg/liter（培养72h时）。Hbid等人(1996)用枯草杆菌S499进行20L发酵罐发酵，通过改变发酵过程中氧传递的控制来控制伊枯草菌素的产量，最高产量达到1388mg/liter。在这一阶段的研究工作中主要面临的困难是泡沫溢出的问题，而化学消泡剂的使用又受到限制，因为化学消泡剂影响氧的传递速率并影响微生物的生理特性。

第二阶段（1992-2007）是固体发酵（solid stated fermentation,SSF）,日本东京技术学院资源利用研究室是该阶段的重要贡献者。Akihiro等人（1993，1995）用小麦麸皮作为底物进行伊枯草菌素的生产，其产量较深层发酵提高了5-6倍，之后他们尝试用豆腐下脚料作为发酵底物，其产量较深层发酵提高了6-8倍。Mizumoto等人（2006，2007）固体发酵生产iturin，其产量分别达到3300mg/kg湿固体培养基和5591μg/g湿固体培养基。固体发酵较深层发酵的优势是发酵过程简单，菌体和产物浓度更大，而且提取时要用的溶剂更少。但因为固态发酵生产设备受到诸多因素的限制，易污染杂菌等问题，使该技术应用于大规模发酵生产受到严重制约。