[发明专利]用于从标本中对百日咳鲍特菌红霉素耐药性进行快速检测的引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学检测领域，涉及一种致病菌的临床实验室检测方法，尤其涉及一种不依赖病原菌分离培养的，用于从标本中对百日咳鲍特菌的红霉素耐药性进行快速检测的引物及检测方法。

技术背景

百日咳是一种由百日咳鲍特菌感染引起的传染病，人群各个年龄均可感染。百日咳鲍特菌是一种革兰阴性杆菌，体外培养营养要求较高，为专性需氧的一种苛养菌。临床上报道的百日咳鲍特菌分离培养率极低，甚至可低于10%，且出具报告所需时间较长（7天-10天）；而我国的多数研究中，所报道的百日咳鲍特菌分离培养率为“零”。研究认为，在一些疫苗高覆盖率国家，百日咳的发病随着疫苗的高覆盖率出现了大大降低，而近年来，百日咳的发病却呈现逐年上升的趋势，这一现象称为“百日咳重现”。

红霉素是治疗百日咳感染和密切接触者预防服药的首选抗生素。而常规检测百日咳鲍特菌的抗生素敏感试验需要有成功的临床标本百日咳鲍特菌分离培养才能完成。但由于百日咳鲍特菌生长较为缓慢，即使有可用于抗生素敏感试验的临床菌株，完成百日咳鲍特菌抗生素敏感性试验也需要数日的时间。

全球首例红霉素耐药百日咳鲍特菌最早于1994年发现于美国，之后美国，法国和我国相继都陆续有个别相关报道，而我国近年来共有6例成功的百日咳鲍特菌分离培养的报道，而且所有6株细菌都表现为红霉素耐药。提示和其它国家不同，我国的红霉素或大环内酯类抗生素耐药百日咳鲍特菌感染可能较为普遍。

当前的研究表明，百日咳鲍特菌红霉素耐药现象与其基因组23S rRNA基因Ⅴ区中的一个核苷酸位点突变有关，即A2047G。之后的多篇报道都证实了发生红霉素或大环内酯类抗生素耐药的百日咳鲍特菌中，均发现有23S rRNA基因的A2047G突变发生。

而目前所有发表的文献中关于百日咳鲍特菌红霉素耐药性检测的方法包括以下两类（1）常规的琼脂稀释法、纸片扩散法和E-test法；（2）对百日咳鲍特菌23S rRNA基因Ⅴ区的PCR扩增，并通过测序、限制性片段酶切后电泳观察以及高分辨率溶解曲线技术分析。

而以上百日咳鲍特菌红霉素耐药性检测所使用的方法均有一个最大的缺陷，即必须获得百日咳鲍特菌菌株才能完成，而百日咳鲍特菌极低的分离培养率往往导致该实验无法完成。

而23S rRNA基因在细菌菌属间是具有一定的保守性，也常作为一些细菌的分子鉴定的靶基因，因此从混合有其它未知核酸的标本中直接检测该基因具有一定的理论可行性。因此，特异性PCR的关键是特异性引物的设计。而成功的特异性PCR扩增后，针对其红霉素耐药的分子机制所做的后续检测，则可直接快速的判断标本中的百日咳鲍特菌的红霉素耐药性。

发明内容

为了解决背景技术中存在的百日咳鲍特菌无法成功培养导致其其抗生素敏感试验无法开展，且其抗生素敏感试验的开展较为耗时等技术问题，本发明提供了一种可直接快速的对标本中所感染的百日咳鲍特菌的红霉素耐药性进行检测的引物和检测方法。

本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种用于从标本中对所感染的百日咳鲍特菌的红霉素耐药性进行快速检测的引物，其特殊之处在于：所述引物针对百日咳鲍特菌23S rRNA基因包括2047位点两侧的可变区域。

上述引物的核苷酸序列是：

1505F:5’-GGCACGAGCGAGCAAGTCTC-3’，以及

2118R:5’-TCTGGCGACTCGAGTTCTGC-3’。

一种基于如上所述的引物的对百日咳鲍特菌红霉素耐药性进行检测的方法，其特殊之处在于：所述方法包括以下步骤：

1）采集百日咳鲍特菌核酸阳性标本；

2）采用如权利要求2所述的引物对步骤1）所得到的百日咳鲍特菌核酸阳性标本的23S rRNA基因进行PCR扩增，得到扩增结果；

3）对步骤2）所得到的扩增产物进行电泳，并根据电泳结果初步判断是否扩增到百日咳鲍特菌23S rRNA基因。

上述步骤3）之后还包括：

4）对步骤2）得到的扩增产物进行DNA测序，得到测序结果；

5）根据步骤4）所得到的测序结果与野生型百日咳鲍特菌进行比对，确定步骤1）所采集得到的百日咳鲍特菌核酸阳性标本是否含有对红霉素耐药的百日咳鲍特菌。

上述步骤1）的具体实现方式是：

1.1）采集临床百日咳疑似病例的鼻咽拭子标本；

1.2）将步骤1.1）所采集得到的临床百日咳疑似病例的鼻咽拭子标本放置于0.5ml生理盐水中并提取DNA；