[发明专利]一种生产漆酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种漆酶的生产方法。 

  

背景技术

漆酶（Laccase）是一类含铜的多酚氧化酶，不仅存在于漆树的分泌物中，而且广泛地存在于多种植物、昆虫和高等真菌中。漆酶在生物纸浆及其漂白、环境污染治理、生物除污、饲料加工及堆肥、食品工业、新能源、有机合成、生物及免疫检测等方面均有广泛的应用。 

真菌资源丰富，同时产酶周期短，生产成本低，目前用真菌生产漆酶备受关注。最为常用的是液体发酵法生产漆酶，如：中国专利公开号CN101643706A，于2010年2月10日公开了“一种耐热产漆酶杈戴氏霉菌株及其产漆酶培养方法”，其利用杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株液体发酵法生产漆酶，其生产的漆酶pH范围较窄，酶活较低，其热稳定性较差。 

固定化技术是20世纪50年代兴起的一种新型生物技术，包含固定化酶和固定化细胞技术。所谓固定化细胞技术，是指利用物理或化学手段将游离的细胞与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术。该技术可以大幅度提高参加反应的微生物浓度，催化效率高；减少所用微生物数量；微生物被高分子材料包埋，耐环境冲击；产物分离提取容易；操作稳定性好。 

固定化细胞的制备方式是多种多样的，一般来说，大致可以分成结合法、交联法、包埋法、共固定及吸附法等六大类，吸附法是利用微生物和载体之间的吸附能力，将微生物结合在载体表面，形成微生物－载体复合物。各种有机的和无机的载体都可以用于固定化细胞，包括活性炭、HGC、尼龙网、聚氨酯泡沫、琼脂糖凝胶和多孔陶瓷等。选择一个好的固定化细胞载体是固定化细胞技术的关键，理想的载体应具有与菌丝良好的结合性能，细胞外液清澈，对微生物无毒性、传质性能好、性能稳定、不易被微生物降解、强度高、寿命长和价格低廉等特点。 

  

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种漆酶的pH范围宽、酶活高，能提高漆酶热稳定性的生产漆酶的方法。 

一种生产漆酶的方法，包括如下步骤： 

（1）将杈戴氏霉GZUIFR-H104.1真菌菌株接种到PDA培养基上，置于35℃恒温培养箱中培养7天后，将其孢子用0.01%的吐温-80的无菌水洗下，配制成1× 10⁷/ml的孢子悬浮液；

（2）将5ml孢子悬浮液用微量移液器接种到300ml的三角瓶中装入100ml的产酶培养基中进行液体振荡培养；

（3） 在恒温30-55℃条件下培养48h后，加入灭菌后的0.001-0.002g 活性炭，继续振荡培养5-12d；

（4）收集发酵液，于6000rpm下离心8min，取上清夜即获得粗酶液。

上述一种生产漆酶的方法，其中产酶培养基配方为：葡萄糖20g，草酸铵2.56g，K₂HPO₄1g，MgSO₄ 0.5g，CuSO₄·5H₂O 0.01g，维生素B1 0.015g。 

上述一种生产漆酶的方法，其中杈戴氏霉GZUIFR-H104.1，菌株保藏号为：CCTCC M 209119。 

本发明与现有技术相比，具有明显的优点及有益效果，从以上技术方案可知：本发明利用活性炭作为载体，利用固定化细胞技术发酵生产漆酶，使所述菌株GZUIFR-H104.1产漆酶的pH范围较液体培养的pH范围要宽；并且漆酶酶活在试验的温度范围内比液体培养的漆酶酶活要高；其热稳定性也有了相应的提高。 

  

具体实施方式

以下结合生产步骤及参数的选择的实验例，对依据本发明提出的一种生产漆酶的方法，其较佳实施方式，详细说明如后。 

试验例：工艺的选择

采用杈戴氏霉GZUIFR-H104.1（菌株保藏号为：CCTCC M 209119，2009年5月30日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国 武汉 武汉大学；分类命名 Taifanglania furcata GZUIFR-H104.1），属于粪壳菌目、戴氏霉属，能产漆酶、耐高温的单瓶梗菌株）在液体振荡培养条件下可以形成自絮凝菌丝球的特点，采用在振荡培养条件下固定菌丝。

一、载体及用量的选择 

（1）载体的选择