[发明专利]一种生产漆酶的方法在审
申请号: | 201310742301.7 | 申请日: | 2013-12-30 |
公开(公告)号: | CN103834621A | 公开(公告)日: | 2014-06-04 |
发明(设计)人: | 韩燕峰;赵丹;张延威;初华丽;邹晓;梁宗琦 | 申请(专利权)人: | 贵州大学 |
主分类号: | C12N9/02 | 分类号: | C12N9/02;C12N11/14;C12R1/645 |
代理公司: | 贵阳东圣专利商标事务有限公司 52002 | 代理人: | 袁庆云 |
地址: | 550025 贵州省*** | 国省代码: | 贵州;52 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 生产 方法 | ||
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体来说涉及一种漆酶的生产方法。
背景技术
漆酶(Laccase)是一类含铜的多酚氧化酶,不仅存在于漆树的分泌物中,而且广泛地存在于多种植物、昆虫和高等真菌中。漆酶在生物纸浆及其漂白、环境污染治理、生物除污、饲料加工及堆肥、食品工业、新能源、有机合成、生物及免疫检测等方面均有广泛的应用。
真菌资源丰富,同时产酶周期短,生产成本低,目前用真菌生产漆酶备受关注。最为常用的是液体发酵法生产漆酶,如:中国专利公开号CN101643706A,于2010年2月10日公开了“一种耐热产漆酶杈戴氏霉菌株及其产漆酶培养方法”,其利用杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株液体发酵法生产漆酶,其生产的漆酶pH范围较窄,酶活较低,其热稳定性较差。
固定化技术是20世纪50年代兴起的一种新型生物技术,包含固定化酶和固定化细胞技术。所谓固定化细胞技术,是指利用物理或化学手段将游离的细胞与固态的不溶性载体相结合,使其保持活性并可反复使用的一种技术。该技术可以大幅度提高参加反应的微生物浓度,催化效率高;减少所用微生物数量;微生物被高分子材料包埋,耐环境冲击;产物分离提取容易;操作稳定性好。
固定化细胞的制备方式是多种多样的,一般来说,大致可以分成结合法、交联法、包埋法、共固定及吸附法等六大类,吸附法是利用微生物和载体之间的吸附能力,将微生物结合在载体表面,形成微生物-载体复合物。各种有机的和无机的载体都可以用于固定化细胞,包括活性炭、HGC、尼龙网、聚氨酯泡沫、琼脂糖凝胶和多孔陶瓷等。选择一个好的固定化细胞载体是固定化细胞技术的关键,理想的载体应具有与菌丝良好的结合性能,细胞外液清澈,对微生物无毒性、传质性能好、性能稳定、不易被微生物降解、强度高、寿命长和价格低廉等特点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种漆酶的pH范围宽、酶活高,能提高漆酶热稳定性的生产漆酶的方法。
一种生产漆酶的方法,包括如下步骤:
(1)将杈戴氏霉GZUIFR-H104.1真菌菌株接种到PDA培养基上,置于35℃恒温培养箱中培养7天后,将其孢子用0.01%的吐温-80的无菌水洗下,配制成1× 107/ml的孢子悬浮液;
(2)将5ml孢子悬浮液用微量移液器接种到300ml的三角瓶中装入100ml的产酶培养基中进行液体振荡培养;
(3) 在恒温30-55℃条件下培养48h后,加入灭菌后的0.001-0.002g 活性炭,继续振荡培养5-12d;
(4)收集发酵液,于6000rpm下离心8min,取上清夜即获得粗酶液。
上述一种生产漆酶的方法,其中产酶培养基配方为:葡萄糖20g,草酸铵2.56g,K2HPO41g,MgSO4 0.5g,CuSO4·5H2O 0.01g,维生素B1 0.015g。
上述一种生产漆酶的方法,其中杈戴氏霉GZUIFR-H104.1,菌株保藏号为:CCTCC M 209119。
本发明与现有技术相比,具有明显的优点及有益效果,从以上技术方案可知:本发明利用活性炭作为载体,利用固定化细胞技术发酵生产漆酶,使所述菌株GZUIFR-H104.1产漆酶的pH范围较液体培养的pH范围要宽;并且漆酶酶活在试验的温度范围内比液体培养的漆酶酶活要高;其热稳定性也有了相应的提高。
具体实施方式
以下结合生产步骤及参数的选择的实验例,对依据本发明提出的一种生产漆酶的方法,其较佳实施方式,详细说明如后。
试验例:工艺的选择
采用杈戴氏霉GZUIFR-H104.1(菌株保藏号为:CCTCC M 209119,2009年5月30日在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏地址:中国 武汉 武汉大学;分类命名 Taifanglania furcata GZUIFR-H104.1),属于粪壳菌目、戴氏霉属,能产漆酶、耐高温的单瓶梗菌株)在液体振荡培养条件下可以形成自絮凝菌丝球的特点,采用在振荡培养条件下固定菌丝。
一、载体及用量的选择
(1)载体的选择
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