[发明专利]降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法

说明书

技术领域      

本发明属于动物繁殖技术领域，特别涉及一种降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法。

背景技术      

哺乳动物精液畸形率较高时和活力较低时会导致其受胎率低下，例如：我国制定了“牛冷冻精液国家标准”，标准中明确规定新鲜精液精子活力≥65%，精子畸形率≤15%；冷冻精液解冻后精子活力≥35%，精子畸形率≤18%。目前人类精子广泛采用密度梯度离心法、过滤柱法等去除低活力精子，应用于人工授精后取得一定效果，但存在以下问题：1、试剂盒价格昂贵，成本相对较高；2、反复离心操作可能会给精子造成物理损伤，精液冷冻后质量有所下降；3、试剂盒残留物难以彻底去除，是否对受胎后续有影响尚需试验证实。为了降低畸形精子比率、提高精子活力，进而提高其受胎率，研究开发了降低精液畸形率和死精率的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，是通过上游法，利用活精子具有较强游动能力的特点，与死精子、活力低的精子、未成熟的精子、畸形精子、白细胞等物质分离，降低牛、羊精液中畸形精子和死精子比率，从而提高精子活力，达到受精受胎的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(一)、Staining  Talp稀释液的配置：

NaHCO₃                                         10mmol/L，

        Hepes                     40mmol/L，

MgCl₂                                           0.4mmol/L，

NaLactate                 25mmol/L，

KCl                       3mmol/L，

Glucose                   5mmol/L，

NaCl                      95mmol/L，

Na₂HPO₄                                        0.3mmol/L，

NaPyruvate                2mmol/L，

0.3%BSA                   3g/L；

以上成分依次溶解入超纯水中，最终体积定容至1L；

（二）、Staining  Talp稀释液的保存：     

    Staining  Talp稀释液保存在4℃，保存期限为两周；

（三）、上游法处理新鲜精液：

（1）提前37℃预热容器，再将4ml Staining  Talp稀释液预热至37℃后，置于容器内；

（2）选取活力区间为40%-60%的新鲜精液，取1ml注入容器内Staining  Talp稀释液的底部，37℃温浴30分钟；

（3）吸出顶部4ml精液，将吸出的4ml精液3000rpm/min离心5分钟，弃掉3 ml上清液，保留底部1ml精液；

 （四）、精液各项指标检测：

（1）精子活力检测：

预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟，用移液器离心管从步骤（三）（3）的底部1ml精液中取15μl样品，滴在准备好的载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，选择压片均匀的样品区域观察，一个压片取5个视野，中间1个，四周各取1个，分别计数活精子数和死精子数，并计算活力；

精子活力=活精子数/活精子数与死精子数的和；

（2）畸形率检测：

A、从步骤（三）（3）的底部1ml精液中取一滴精液滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片成35°夹角，将样品均匀地涂抹于载玻片上，自然风干约5 min，每样品制作2个抹片；

B、在已风干的抹片上滴上1.0 mL～2.0 mL0.05%福尔马林，pH值为6.5-7.5，固定15 min后用清水缓缓冲去福尔马林，吹干或自然风干；