[发明专利]一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用于核酸检测的试剂，具体讲，涉及一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂。

背景技术

1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病，参加者中超过200人发生肺炎，其中34人遇难。经研究，发现一种细菌命名为嗜肺军团菌。随后，许多有关细菌暂被列入这一属，且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例。现已提出了超过30种军团杆菌，至少19种是人类肺炎的病原。其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%)，这次事件反映了嗜肺军团菌并非小面积的人与人的传染。加强水资源管理及人工输水管道和设施的消毒处理，防治军团菌造成空气和水源污染，是预防军团菌病扩散的重要措施，嗜肺军团菌的快速检测对该疾病的防控具有重要的意义。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的核酸检测技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，在60℃～65℃恒温扩增， 60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强等特点。该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应。其扩增结果可以通过凝胶电泳、肉眼观察焦磷酸镁沉淀或加入荧光物质后的颜色改变来做初步的判断。但该方法也有一定的缺陷，主要表现在扩增结果检测环节，凝胶电泳检测容易造成污染，焦磷酸镁沉淀检测灵敏度较差，荧光物质变色方法受到荧光物质的成本或者需要使用检测仪器的限制。因此，在产物检测环节的限制，影响了该技术的推广应用。

本发明公开了一种新型的等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂。该方法具有本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高，结果判断更准确的优势。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂。

本发明的第二发明目的在于提供一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测方法。

本发明的第三发明目的在于提供这种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂盒的应用。

发明的主要技术方案为：

1. 等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂的组成为：

（1）核酸恒温标记扩增反应试剂

核酸恒温扩增反应液中含有前外引物、后外引物、前促环引物、后促环引物、前内引物、后内引物、dNTPs溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶（如：Bst DNA聚合酶等）、MgSO₄、无菌双蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。

环介导等温扩增的缓冲液的最终工作浓度为20 mM Tris-HCl、10 mMKCl、10 mM  (NH₄)₂SO₄、2 mM MgSO₄以及质量浓度为0.1% Triton X-100，缓冲液的pH值为8.8。

其中前外引物、后外引物、前促环引物、后促环引物、前内引物、后内引物均为人工合成的脱氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、后外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、前促环引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3、后促环引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4、前内引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5、后内引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，上述引物分别与待测基因的相应位置互为反义互补序列，上述引物能够在等温条件下以环介导的方式检测待测基因。将前内引物的5’端标记上生物素基团，将后内引物的5’端标记上异硫氰酸荧光素基团。

各引物的具体核苷酸序列如下：

SEQ ID NO:1 5’- AAGATGAAATTGGTGACTGCAGC -3’,

SEQ ID NO:2 5’- AGCAGTACGTTTTGCCATCA -3’,

SEQ ID NO:3 5’- CCGATGCCACATCATTAGCTACAGACA -3’,

SEQ ID NO:4 5’- TTGGCTTTAACCGAACAGCA -3’,

SEQ ID NO:5 5’- TCGGCACCAATGCTATAAGACAACTAATGTCAACAGCAATGGCTGC -3’,