[发明专利]一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法

权利要求书

1.一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法，其特征是包括如下步骤：

1）取新鲜或-80℃保存的蚯蚓在预冷的研钵中用液氮研磨成蚯蚓粉末；

2）取1g蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，涡旋2-6分钟混匀，于-20℃沉淀6-16小时；离心，弃上清，加入10-30ml质量浓度为0.3%二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后于4℃，离心30分钟，再重复洗涤、离心操作2次；

3）用质量浓度为0.3%的二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，12000×g的离心条件下，离心30分钟，弃上清，挥干沉淀中残余的液体，所述二硫苏糖醇溶液的溶剂为体积浓度为70%-90%的丙酮水溶液；

4）取0.1-0.3g步骤（3）获得的沉淀溶解于1ml蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置5分钟；加入二硫苏糖醇使其终浓度为40-100mM，涡旋混匀，冰上静置10分钟；

5）冰浴下，以250-350W功率，2s/6s超声25-35个循环，13500×g离心40分钟，取上清-80℃分装保存；

所述蛋白提取液用下述方法制成：取10-30g三氯乙酸和0.3g二硫苏糖醇加丙酮至100ml溶解；

所述蛋白裂解液用下述方法制成：取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去离子水定容至10ml。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤（2）为：取1g蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，涡旋4分钟混匀，于-20℃沉淀10小时；离心，弃上清，加入20ml质量浓度为0.3%二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后于4℃，离心30分钟，再重复洗涤、离心操作1次。

3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于所述蛋白提取液用下述方法制成：取20g三氯乙酸和0.3g二硫苏糖醇加丙酮至100ml溶解。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤（3）为：用质量浓度为0.3%的二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，12000×g的离心条件下，离心30分钟，所述二硫苏糖醇溶液的溶剂为体积浓度为80%的丙酮水溶液；挥干液体。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤（4）为：取0.1g步骤（3）获得的沉淀溶解于1ml蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置5分钟；加入二硫苏糖醇使其终浓度为65mM，涡旋混匀，冰上静置10分钟。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤（5）为：冰浴下，以300W功率，2s/6s超声30个循环，13500×g离心40分钟，取上清-80℃分装保存。