[发明专利]一种用于甲型流感病毒一步反转录定量PCR检测方法的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明建立了一套基于甲型流感病毒基质蛋白基因，适用于所有甲型流感病毒的一步反转录实时FRET-PCR方法，是大批量筛选甲型流感病毒最可靠的检测手段。涉及该系统中所使用的引物、探针及试剂盒。

背景技术

流感病毒分甲、乙、丙三型，甲型流感病毒因其抗原易变异、进化快、感染性和致病性较强、传播速度快而成为季节性流感和历史上流感大流行的主要病毒，根据其表面糖蛋白HA和NA的不同抗原性，可分为16个HA亚型和9个NA亚型。其中甲型流感病毒抗原性持续不断发生变异，以HA基因变异最为主要且变异频率最高。甲型流感病毒的现有检测技术包括病毒分离培养、HA与HI、ELISA、免疫胶体金、反转录-PCR、LAMP等技术。分离培养是检测病毒的“金标准”，但其培养时间长；分子生物学检测大多是针对不同亚型，筛选所有甲型流感病毒有一定局限性；ELISA虽然敏感性高、操作简便、便于大规模检测，但特异性不高；胶体金主要用于暴发疫情初筛大量病例的快速检测，但灵敏度较低，检出率不高，应用受到限制。现有的反转录-PCR、LAMP等分子检测技术，多采用二步法PCR，有反转录效率不高等缺点；而且，现存的分子检测技术多依赖于特异性不强的SYBR Green I等定量PCR平台；多数PCR是针对特定的HN血清型，以Hemagglutinin(HA)gene和Neuraminidase(NA)gene等易变异基因作为扩增目标。甲型流感病毒的抗原易变性和传播速度给甲型流感的检测和防控造成很大困难，严重威胁人类和动物的健康，因此亟需一种针对所有甲型流感病毒的精准而又快速高效的广谱检测和监控技术。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于甲型流感病毒一步反转录定量PCR检测方法的引物、探针及试剂盒。

本发明通过下述一系列工作从而建立甲型流感病毒一步反转录定量PCR检测方法的引物、探针及试剂盒。

1）基因选择：

甲型流感病毒包括8条单链负股RNA片段，其中片段1-3分别编码PA、PB1、PB1-F2和PB2聚合酶蛋白，片段4和片段6分别编码血凝素蛋白HA和神经氨酸酶蛋白NA，片段5编码核蛋白NP，片段7编码病毒基质蛋白M1和离子通道蛋白M2，片段8编码非结构蛋白NS1和NS2。根据不同的基因片段（如基质蛋白基因，HA基因，NA基因等），已有多种对甲型流感病毒进行分型和亚型的检测技术。其中HA基因和NA基因遗传多变，而聚合酶蛋白基因序列有限，仅有核蛋白基因，基质蛋白基因和非结构蛋白基因的分析研究较多。鉴于不同亚型的甲型流感病毒基质蛋白基因序列较保守，因此本系统选择基质蛋白基因作为目的基因。

2）获得基质蛋白基因的序列：

从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下代表株的基质蛋白基因序列：H3N2：AB741561；H5N1：GU183427；H3N8：AB775625；H9N2：DQ997457；H4N6：HM142732；H1N1：GU066781；H5N2：HM765510；H6N2：AB775617；H6N1：DQ376657；H10N7：CY077041；H7N7：GU053111；H7N9:KF695257；H1N2：KF836384；H2N3：CY122008；H4N8：EU580555。用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对，寻找甲型流感病毒基质蛋白基因的相对保守序列。据此，设计的引物和探针。

本发明所述的用于甲型流感病毒一步反转录定量PCR检测方法的引物和探针，其序列如下：

上游引物fluAUP-1：   5’-GCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTT-3’（SEQ ID NO.1）

下游引物fluADN-2：      5’-GACAAAATGACCATCGTCAACATCCACA-3’（SEQ ID NO.2）

6-FAM fluAFLU：      5’-CTACGGAAGGAGTACCTGAGTCTATG-(6-FAM)-3’（SEQ ID NO.3）

LCRed640fluLCRed640：   5’-(LCRed-640)-GGGAAGAATATCGGCAGGAACAGCAGA-磷酸-3’

（SEQ ID NO.4）。