[发明专利]基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法

权利要求书

1.基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，按照下述步骤进行：首先，以氧化石墨烯、FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O为前驱体，采用用二甘醇溶剂热法合成了具有更好分散性的Fe₃O₄/rGO，进一步探究Fe₃O₄/rGO催化的显色反应与H₂O₂浓度的对应关系；然后，在乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的双酶体系催化下，乙酰胆碱分解产生H₂O₂；最后，在酶催化反应后的溶液中直接加入Fe₃O₄/rGO，催化乙酰胆碱分解的H₂O₂氧化TMB产生显色反应，建立乙酰胆碱浓度和溶液颜色吸光度的线性关系，实现乙酰胆碱的比色检测。

2.根据权利要求1所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，具体制备步骤如下：

（1）Fe₃O₄/rGO的制备：首先将FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O加入到含有氧化石墨烯的二甘醇溶液中，其中FeCl₂·4H₂O、FeCl₃·6H₂O和二甘醇溶液的加入量比为：0.5：1：10 mmol/ mmol/mL，氧化石墨烯与二甘醇的用量比为5:10 mg/mL；并在90 oC下搅拌30 min；然后逐滴加入含0.8 M NaAc的二甘醇溶液，其中含有氧化石墨烯的二甘醇溶液与含NaAc的二甘醇的体积比为1:1；搅拌10 min后，将混合液转移到反应釜中，200℃下加热6 h；最后将产品冷却到室温，用乙醇洗涤数次后置于50℃真空烘箱中烘干；

（2）H₂O₂浓度与反应体系吸光度的对应关系：首先将965 μL 含有0.5 mg TMB的醋酸缓冲溶液ABS, 0.2 M, pH 4.0，分别和10 μL不同浓度0、0.01、0.02、0.1、0.2、1、10、20、40 mM的H₂O₂混合均匀；然后分别加入25 μL 2 mg·mL^–1的Fe₃O₄/rGO，混合均匀后在室温下温育15 min；最后，通过外加磁场（磁铁）去除反应体系中的Fe₃O₄/rGO，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下分别测量并记录含不同浓度H₂O₂反应溶液的吸光度，绘制标准曲线；

（3）乙酰胆碱的酶催化反应：将200 μL含有0.5单位的乙酰胆碱酯酶和0.5单位的胆碱氧化酶的磷酸缓冲溶液PBS, 10 mM, pH 7.4分别与不同量0、5×10^–5、10^–4、5×10^–4、10^–3、10^–2、10^–1、1、10 μmol的乙酰胆碱混合均匀，于37℃下温育反应30 min；

（4）乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系：800 μL含0.5 mg TMB和50 μg Fe₃O₄/rGO的ABS，分别加入到步骤（3）温育后的溶液中混合均匀，在室温下温育30 min；然后，通过外加磁场（磁铁）去除反应体系中的Fe₃O₄/rGO，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下测量反应溶液的吸光度；最后，建立乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系并绘制标准曲线。

3.根据权利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，其特征在于：步骤（1）中含GO的DEG溶液是在连续超声2 h条件下制备的均一溶液。

4.根据权利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，其特征在于：所述的Fe₃O₄/rGO磁性纳米颗粒平均粒径为10 nm。