[发明专利]用于检测B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种用于检测B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸，采用实时荧光定量PCR技术，可用于检测人类白血病患者体内B型TEL-ABL融合基因是否存在及其表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查，可有效地节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

TEL-ABL（又可称为ETV6-ABL）融合基因于1995年首次被报道于国外学者Papadopoulos的研究中。TEL基因位于人类12号染色体短臂1区3带，ABL基因位于人类9号染色体长臂3区4带。这两种基因融合时可能会产生三种断裂方式，但在mRNA水平上，最终只会出现两种转录体，即A型融合基因和B型融合基因。这两种类型的融合基因在ABL端的断裂位置是一致的，即在A型融合基因和B型融合基因中，ABL端均起始自ABL基因的2号外显子。不同的是：A型融合基因在TEL端的断裂位置位于TEL基因的4号外显子；B型融合基因在TEL端的断裂位置位于TEL基因的5号外显子。这样的融合方式也说明了TEL基因的5号外显子不是TEL-ABL融合基因导致白血病产生所必需的。

现有的研究已发现TEL蛋白的HLH结构域可通过寡聚化让酪氨酸激酶不依赖配体而持续激活，从而形成血液肿瘤。TEL蛋白的HLH结构域也可与一些转录因子形成融合蛋白。TEL-ABL融合基因编码的TEL-ABL融合蛋白是由TEL蛋白的HLH结构域和ABL蛋白的酪氨酸蛋白激酶活性域嵌合而成的。TEL基因和BCR基因均有使ABL受体酪氨酸激酶寡聚化的能力，因而使得TEL-ABL融合基因的致病机理与BCR-ABL融合基因有些类似：TEL蛋白提供氨基端的HLH结构域，在产生的融合蛋白中HLH结构域的二聚化作用下，使得非受体型酪氨酸激酶ABL基因持续表达而使细胞恶性增殖，导致白血病发生。

在已报道的TEL-ABL融合基因阳性病例中，患者的男女比率为2.6:1，平均诊断年龄为48岁，其中多数患者为慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia,CML）患者，其它也包括了急性髓系白血病未分化型（acute myeloid leukemia-M1，AML-M1）、慢性骨髓增生瘤（chronic myeloproliferative neoplasm，cMPN）及急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者。

目前，抑制这种融合基因的有效药物仍以酪氨酸激酶抑制剂为主（与BCR-ABL融合基因相似）。多篇研究报道了在体外实验中，酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼和尼罗替尼，可以控制TEL-ABL融合基因阳性细胞的生长。即便如此，TEL-ABL融合基因阳性患者的预后仍较不理想。在已报道的TEL-ABL融合基因阳性患者中，死亡率约为65%，而且对ALL幼儿患者而言，TEL-ABL融合基因阳性将会是一个预后不良的指标。因此，对TEL-ABL融合基因进行定量监测，是判断和追踪该融合基因阳性的白血病患者疗效的良好指标，可以较好地反映患者微小残留病灶(Minimal Residua Disease，MRD)的动态变化。

目前临床上已经将TEL-ABL融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、逆转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RQ-PCR)等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是实验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，判读结果存在较大的主观性。而单纯的RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。鉴于MRD是白血病患者复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对TEL-ABL融合基因mRNA的MRD进行检测。

RQ-PCR方法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时在线检测，反映TEL-ABL融合基因在样品中的初始含量，从而节约了大量的检测时间，还避免了污染的发生。常见的实时荧光定量PCR法有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。