[发明专利]一种热稳定性好的β‑葡聚糖酶的制备方法

权利要求书

1.一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述热稳定性好的β-葡聚糖酶由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)β-10-25通过发酵法制得，菌种保藏号为CCTCC NO:M2013538。

2.如权利要求1所述一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M2013538的斜面菌种活化培养获得液体种子；将一级种子罐发酵液以3％接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量V/V 1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h；

发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶。

3.如权利要求2所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，种子培养基组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH4.5-7.0。

4.如权利要求2所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值4.5-7；

所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值4.5-7，加入3u中温淀粉酶/g玉米粉与30u高温淀粉酶/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，pH4.5-7，备用。

5.如权利要求4所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；麦冬10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，混合物中乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5，110W超声萃取0.5～1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。

6.如权利要求5所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。

7.如权利要求2所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)液体种子扩大培养

①一级种子培养：将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40℃，培养时间10h；

②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子培养相同；

③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40℃，培养时间12h；

④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41℃，搅拌速度300rpm，通风量V/V 1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；

种子培养基组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH5.5，121℃灭菌35min；

(2)发酵罐发酵

将一级种子罐发酵液以3％接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度37℃，搅拌速度250r/min，通风量V/V 1:1-3,培养时间12h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养18h；此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养12h；

所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药粉剂40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min；

所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值5.5，加入3u中温淀粉酶/g玉米粉与30u高温淀粉酶/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温20min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，pH5.5，121℃灭菌35min备用；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；麦冬12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，11W超声萃取1h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；所述混合酶添加量为混合物料总重量的8％；

所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶18份，果胶酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份；乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2；

(3)发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶；

经上述制备方法得到的β-葡聚糖酶液体酶活力为10000u/ml。