[发明专利]一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体及应用。

背景技术

甘蔗黄叶病、花叶病是严重危害甘蔗的农业生产和糖业健康发展的病毒病，甘蔗黄叶病属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒(Polerovirus)，其病毒由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正义RNA(ssRNA)构成，在甘蔗体内含量很低，仅分布于其韧皮部筛管伴胞细胞质中。在全球30多个种植甘蔗的国家和地区均有发生，自2003年王伯辉等报道广西发现甘蔗黄叶病以来，在我国桂、粤、滇、琼、闽等蔗区也陆续出现，且有逐年加重的趋势。该病的发生导致甘蔗产量下降,品质变劣以及种性退化,严重时甘蔗产量减产高达40%~60%。而甘蔗花叶病属于马铃薯Y病毒组，其基因组为正单链RNA,约有10000个核苷酸，主要破坏甘蔗叶片的叶绿体，制约其光合作用，从而使甘蔗糖分减少，产量下降。据统计当该病病毒侵染率达到75%时，产量降低5%~19%，严重影响甘蔗产量。该病在我国广东、广西、浙江、福建、云南、江西、四川、台湾均有分布。螟虫是我国蔗区发生最普遍,危害最严重的甘蔗害虫,具有全生长季、钻蛀性危害的特点,苗期枯心率一般达10%~20%,严重的高达60%，Bt基因产生的毒蛋白对螟虫具有防治作用。甘蔗生长旺季田间管理难度大，人工成本高，随着我国甘蔗机械化栽培管理的逐步推广，减少田间管理成本的除草剂甘蔗品种更适宜机械化栽培管理模式。由于甘蔗是高度杂合的异源多倍体和多倍的非整倍体植物，其遗传背景非常复杂，并且抗病虫、除草剂的甘蔗资源缺乏，因此，很难通过杂交育种的方式获得高抗植株。

目前，转基因技术在植物抗病虫害方面已广泛应用。2011年张雨良等以甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因构建RNAi表达载体，并成功转化到烟草中。2012年秦荣等利用RNAi技术成功构建了抗甘蔗花叶病、番茄花叶病的双价表达载体，2004年姚伟等获得转ScMV-CP基因的转基因甘蔗并进行了抗病分析，结果转基因甘蔗抗性明显高于非转基因甘蔗。2006年Weng等利用基因枪法将玉米泛素启动子Ubi驱动下的s-Cry1Ac导入甘蔗，用获得了抗蛀茎虫的转基因甘蔗，2011年高世武等利用PPT筛选成功获得抗螟虫转基因甘蔗。甘蔗病虫害往往是多种同时出现，并趋于多样性，而现今获得的转基因甘蔗多属单一抗性的转基因改良，对甘蔗病虫害防治作用有限。对于感病毒病的作物，RNAi技术已经成为抗病毒转基因作物育种的有效途径。然而，到目前为止，同时抗两种病毒病并具有抗虫、抗除草剂的转基因甘蔗尚未见报道。本发明通过将甘蔗花叶病毒、黄叶病毒CP基因干扰序列、Cry1AC基因和抗除草剂Bar基因同时构建到植物表达载体上，利用基因枪创制了抗病虫和除草剂的四价转基因甘蔗，为培育多抗甘蔗新品种提供了新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，可用于转化获得同时具有4种抗性的转基因作物，并且获得的转基因作物没有抗生素抗性基因，可提高转基因作物的安全性。

本发明首先提供了一种甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列，是由甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的保守序列融合而成，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。

一种甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰结构，是将所述的甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列以反向重复的方式与丙酮酸磷酸双激酶PPDK内含子相连，以35S为启动子，OCS终止子，如图2所示。

本发明还保护了所述的甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列在甘蔗转基因中的应用。

本发明还提供了一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，所述载体的T-DNA区结构（如图1所示）为：右边界-35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子-Ubi启动子-抗虫基因-NOS终止子-NOS启动子-抗除草剂基因-NOS终止子-左边界，T-DNA区左右边界内无抗生素基因，其中正向双价抗病序列即甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。其中内含子为丙酮酸磷酸双激酶PPDK内含子。

所述抗虫基因为Cry1AC基因。

所述抗除草剂基因为Bar基因。

所述载体的构建如下：