[发明专利]支原体培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及一种支原体培养基及其制备方法。

背景技术

支原体（Mycoplasma）是一类无细胞壁、介于病毒和细菌间的原核微生物，能引起人和动物的多种疾病，危害极大。该菌DNA分子量比细菌少，生物合成能力较弱，对培养基营养要求较高，生长除依赖基础营养外，尚需牛心浸液、酵母膏、辅酶Ⅰ、氨基酸等，需要甾醇的支原体，还要加入10%～20%的动物血清。

目前，支原体分离培养常用培养基Hartleys、PPLO、Hayflick，或其他改良的培养基，它们都是以牛心汤为基础配制而成的，此类培养基成本高，培养时间长、效率低，不利于支原体的大量培养，制约了疫苗生产。因此，研究和探求一种材料易得、价格低廉的支原体培养基变得十分迫切。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种材料易得、价格低廉、培养效果好的支原体培养基及其制备方法，以降低支原体的培养成本，便于实现人工大规模培养支原体。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：支原体培养基，包括基础培养液，基础培养液主要由猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液组成。

基础培养液由猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液按体积百分数48%、50%、2%组成。

上述支原体培养基，还包括动物血清。

每90～95ml基础培养液中加入5～10ml无菌的动物血清。

动物血清为马血清或小牛血清。

上述支原体培养基的制备方法，包括以下步骤：

<1>胰腺提取液的制备

取经检疫合格猪的新鲜胰脏，去除脂肪组织，切碎；500g胰脏加入1500ml ddH₂O和500ml无水乙醇，室温振荡，100rpm；72h后用滤纸过滤即得；

<2>猪肺消化汤的制备

取经检疫合格猪的新鲜猪肺，去除气管和淋巴结缔组织，切碎，1500g猪肺加入2000ml ddH₂O，搅拌加热至80℃，再加入质量浓度0.8%的无水NaHCO₃2500ml，混匀后冷至45℃，加入胰腺提取液500ml、氯仿50ml，混匀置37℃6～7h，之后加浓硫酸40ml，100℃蒸汽加热1h，纱布过滤，用1mol/L NaOH溶液调pH至8，100℃蒸汽加热1h，趁热滤纸过滤，调节pH值至7.6，121℃高压灭菌20min，冷却即得；

<3>1%水解乳蛋白胨Earle液的制备

配制原液甲：NaCl68.0g，KCl4.0g，NaH₂PO₄·2H₂O1.4g，葡萄糖20.0g，将以上各成分溶解于500ml水中，即得；

配制原液乙：NaCl2.0g，MgCl₂·6H₂O1.7g，0.4%酚红液50ml，将以上各成分溶解于500ml水中，即得；

配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均匀即得；

将水解乳蛋白胨和Earle液按质量体积比1:100混合完全溶解，装瓶，115℃高压灭菌20min，冷却即得；

<4>25%新鲜酵母浸出液的制备

将250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH₂O中，浸泡1h后加热至沸腾、冷却，3000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8，滤纸初滤后，0.22μl滤膜过滤除菌，即得；

将步骤<2>至<4>获得的猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液按体积百分数48%、50%、2%在无菌条件下混合，即得基础培养液。

上述支原体培养基的制备方法，还包括以下步骤：

<5>培养基的完善

根据不同支原体的培养特性，在无菌状态下，每90～95ml基础培养液中加入5～10ml无菌的动物血清（马血清、小牛血清或其他动物血清），混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10ml，-20℃保存。