[发明专利]重组载体、利用该载体制备的重组杆状病毒以及该病毒在疟疾疫苗制备中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种经改造的杆状病毒载体即重组载体，利用该载体制备的含目的基因（约氏疟原虫表面蛋白Pys48基因）的重组杆状病毒，该重组杆状病毒的制备方法，该重组杆状病毒表达的融合蛋白，以及该重组杆状病毒和该融合蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。 

背景技术

由媒介蚊虫传播的疟疾是一种严重威胁人类生命健康的感染性疾病。据2011年WHO《2011年世界疟疾报告》指出，2010年，在全球106个疟疾流行国家及地区共发现约2.16亿病历，其中86%的疟疾病历是5岁以下儿童。疟疾疫苗的研制和开发是控制疟疾传播的重要策略之一，且随着越来越多的疟原虫耐药株被发现，疟疾疫苗的研制显的尤为重要，不少疟疾疫苗已进入临床试验，现阶段，多时期多价疫苗的研制成为疟疾疫苗研究的热点。 

约氏疟原虫表面蛋白Pys48是其有性生殖阶段配子体时期的表面蛋白，其结构高度保守，含有两段P48-45超家族序列，和其他疟原虫的P48蛋白同源性高，常被用作实验室建立模型为其他疟疾的研究提供参考。 

目前世界上常用大肠杆菌和酵母表达蛋白制备疫苗，而用大肠杆菌表达的蛋白大多数无免疫原性和保护性，酵母表达制备疫苗效果也不是很理想。哺乳细胞表达系统（CHO）等表达系统虽然效果好，但因表达量低，同时需大量培养基和牛血清蛋白，成本高，不适合生产需要。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种重组杆状病毒载体，利用该载体构建表面展示约氏疟原虫Pys48抗原的重组杆状病毒，通过简单地分离纯化病毒粒子，制备抗体具有良好的抗体效价，能够为P48疟疾疫苗的研究提供参考。 

本发明所采用的技术方案为： 

一种重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM，该重组载体由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI 酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID NO：1所示。 

具体地，所述重组序列插入到pFastBacDual载体的KpnI酶切位点和HindIII酶切位点之间。 

本发明进一步提供利用上述重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM构建的重组杆状病毒BmPys48，该重组杆状病毒由约氏疟原虫Pys48抗原基因插入到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有约氏疟原虫Pys48抗原的重组杆状病毒。 

具体地，所述约氏疟原虫Pys48抗原基因插入到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点之间。 

具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 

穿梭载体Bacmid（即Baculovirus plasmid）为带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，为现有技术。 

载体pFastBacDual是Bac-to-bac表达系统的供体质粒，可以插入外源基因并在辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBacDual已经商品化；CMV启动子为哺乳动物启动子，将其插入杆状病毒后，杆状病毒可以在哺乳动物里表达外源基因。 

上述重组杆状病毒BmPys48的制备方法，包括以下步骤： 

（1）通过PCR扩增的方法得到约氏疟原虫Pys48抗原基因，然后将约氏疟原虫Pys48抗原基因连接到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoRI酶切位点和Xho I酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys48-TM；