[发明专利]一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法

权利要求书

1.一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

（1） 菌株的活化：将4℃左右的条件下保存小于一个月的枯草杆菌单菌落接种于种子培养基中，在32-45 ℃，100-300 rpm条件下培养12-24 h进行初次活化，然后按1-5%的接种量第二次将初次活化的枯草杆菌培养液接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

（2）扩大培养：将活化种子液按1-10%的接种量接种于pH6.5-8.5的装有的奶粉-豆粕无菌培养基的发酵罐中，在35-45℃，溶解氧≧35%条件下发酵18-24 h，继续在25-35 ℃发酵18-48 h至内生芽孢生成率≧50%，得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于3000-10000 rpm速度下离心5-30 min,去除上清液，按体积比1：1-5的比例将沉淀的菌体用无菌水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤1-3次，随后用1-5%无菌奶粉液重新悬浮菌体，其活菌数≥10¹⁰ cfu/ml，得菌悬液；

（4）单层微胶囊制备：按1-5%（W/V）的比例将无菌处理的海藻酸钠、0.1-1%（W/V）的阿魏酸和1-2%（W/V）的甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以10-30 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的1-10 ℃冷却的1-10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴加边在100--300 rpm下搅拌，固化30-60 min，无菌水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

（5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊用无菌处理的0.5-5%壳聚糖中覆膜30-60 min，无菌水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

（6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

2.根据权利要求1所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，对步骤（5）中所述双层湿微胶囊进行低温真空干燥为40 ^oC以下的任何一种干燥方式，并真空包装。

3.根据权利要求1所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的枯草杆菌菌株指的是野生型枯草杆菌、基因工程的枯草杆菌中的一种或两种。

4.根据权利要求3所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述奶粉原料为全脂牛奶、脱脂牛奶、羊奶和马奶中的任一种，所述豆粕为玉米豆粕、大豆豆粕和花生粕的任一种。

5.根据权利要求3所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的无菌方法为高温灭菌和过滤除菌中的任一种。

6.根据权利要求4或5所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）（4）（5）中的无菌水为生理盐水、磷酸缓冲液、自来水和蒸馏水的任一种。