[发明专利]一种弧菌数量检测的试剂盒及其制备方法、检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种弧菌数量检测试剂盒及其制备方法、检测方法，更具体的说是一种用于淡水养殖或海水养殖时检测水产品或水样的弧菌数量检测的试剂盒及其制备方法、检测方法。 

背景技术

在现有技术中，近年来随着水产养殖业的快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出，其中细菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成了巨大的损失。弧菌是一大群菌体短小、有端极鞭毛、能运动、无芽孢的短杆状弯曲成弧形的革兰氏阴性菌，隶属弧菌科、弧菌属。大量研究表明，多种弧菌可引起海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的流行性和暴发性死亡，主要包括副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌等。弧菌病给水产养殖业造成巨大的经济损失，并且该病还会导致野生海水鱼类、贝类及甲壳类的死亡，进而威胁海洋自然生物资源。例如，在对虾养殖业种中，弧菌是最主要的细菌性病原，对虾红腿病发病率和死亡率达90%；对虾烂鳃病发病率低，但死亡率很高；急性幼体弧菌病发病后1-2天导致大面积暴发与死亡；对虾荧光病，特别是对虾幼体，发病几天内死亡率为80%-90%，弧菌病一旦蔓延，来势猛烈。因此，对该病害的预防与控制研究一直备受国内外研究人员的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。在水产养殖中，弧菌病的引起与弧菌数量、水质环境、养殖对象、操作管理等有密切的关系，通过弧菌数量检测，在很大程度上对弧菌病的预防与控制有重要的意义与作用。 

目前，检测弧菌数量的常规方法是平板计数法，每次消耗2-3天，培养基保存时间短，难以满足生产急需性和大面积养殖长期使用；DAN探针技术，技术条件要求高，且只能进行定性分析；荧光定量PCR技术，特异性好，敏感性高，但只能用于实验室检测和水体检测。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简易，检测时间短，有效预防与控制弧菌病的弧菌数量检测的试剂盒。 

本发明提供一种弧菌数量检测的试剂盒，包括弧菌稀释液和固体培养基；所述弧菌稀释液为0.009g/ml的氯化钠溶液；所述固体培养基的配方为：酵母膏3-5g、蛋白胨6-10g、蔗糖12-20g、硫代硫酸钠6-10g、柠檬酸钠6-10g、牛胆酸钠1.8-3g、牛胆粉3-5g、氯化钠6-10g、柠檬酸铁0.6-1g、2%溴麝香草酚蓝溶液12-20ml、1%麝香草酚蓝溶液2.4-4ml、琼脂9-15g。 

本发明还提供一种弧菌数量检测的试剂盒的制备方法，包括装有上述所述弧菌稀释液的离心管的制备，以及装有上述所述的固体培养基的培养皿的制备； 

A、装有所述弧菌稀释液的离心管的制备包括以下步骤：

A1：称取9g的氯化钠倒入已装入800ml的蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀；

A2：在烧杯中倒入盐酸或氢氧化钠，将烧杯中的溶液PH值调整到8.5-8.7，再用蒸馏水定容至1000ml，配制成弧菌稀释液；

A3：通过可调试分离器将步骤A2配制的弧菌稀释液注入离心管内；

A4：将装有弧菌稀释液的离心管灭菌后，旋紧离心管的管盖，放入真空包装袋内抽真空；

B、装有所述固体培养基的培养皿的制备包括以下步骤：

B1：取酵母膏3-5g、蛋白胨6-10g、蔗糖12-20g、硫代硫酸钠6-10g、柠檬酸钠6-10g、牛胆酸钠1.8-3g、牛胆粉3-5g、氯化钠6-10g、柠檬酸铁0.6-1g、2%溴麝香草酚蓝溶液12-20ml、1%麝香草酚蓝溶液2.4-4ml、琼脂9-15g倒入装有1100ml蒸馏水的三角烧瓶中，搅拌均匀；

B2：把步骤B1的三角烧瓶在加热炉上煮沸，制成培养液，并倒入盐酸或氢氧化钠，将三角烧瓶中的溶液PH值调整到8.5-8.7；

B3：将步骤B2制得的培养液灭菌后，冷却至55℃-65℃；

B4：在超净台内对自动分液器的储液漏斗消毒，然后将步骤B3冷却至55℃-65℃的培养液分装到培养皿中；

B5：将培养皿平放于超净台上，并打开超净台紫外灯，使培养液冷却凝固成固体培养基；

B6：凝固后，在超净台内，将培养皿的盖子盖上，倒扣后将培养皿取出，放入真空包装袋抽真空。

进一步地，在装有所述弧菌稀释液的离心管的制备过程中，往每个离心管内加入0.9ml的弧菌稀释液，每个真空包装袋装有2支离心管；在装有所述固体培养基的培养皿的制备过程中，用90mm的培养皿接住20ml培养液，每个真空包装袋含有1块装有固体培养基的培养皿。