[发明专利]一种固定化载体及其制备方法和固定化β-葡萄糖苷酶

说明书

技术领域

本发明属于固相化的酶制备领域，更具体地，涉及一种固定化载体及其制备方法和固定化β-葡萄糖苷酶。

背景技术

酶的固定化是指通过物理、化学方法，利用载体将酶限制或束缚在一定的区域内，使酶在此特定区域内进行催化反应的一种酶工程技术。酶的固定化技术因其具有使酶回收及连续化运作，降低生产成本的优势而成为近年来酶工程领域最为活跃的研究重点之一。

磁性纳米颗粒作为固定化载体，由于利于分离和再利用因此应用广泛。目前磁性纳米颗粒载体的制作方法主要用壳聚糖包裹磁性纳米核，在壳聚糖表面交联戊二醛。

然而，这种方法制备的磁性纳米颗粒固定化载体，由于采用共价键合作用力将酶分子与载体共价交联在一起，作用力过强，导致酶的三级结构、活性结构域受到不同程度的破坏，对酶活力会造成影响，和游离生物酶相比，活力大幅降低。

β-葡萄糖苷酶，是催化纤维素降解的关键酶，固定化的β-葡萄糖苷酶在生物质能源、食品储存发酵工业、生物医药等领域都有重要应用。目前固定化的β-葡萄糖苷酶，主要是采用共价键合作用力、物理吸附力或包埋法等方法与功能性磁性纳米颗粒结合。其中，共价键合作用力过强，造成酶的催化结构域和底物结合结构与都遭到不同程度的破坏，酶活降低；物理吸附力，作用力过若，结合不牢固，导致多次使用后生物酶流失，批次使用效果不稳定；包埋法，β-葡萄糖苷酶的活性位点受到载体的阻碍，影响传质阻力，导致催化效率降低。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种固定化载体及其制备方法和固定化β-葡萄糖苷酶，其目的在于采用金属离子配位键将如β-葡萄糖苷酶的生物酶与磁性纳米颗粒结合，形成固定化的生物酶，由此解决目前磁性纳米颗粒固定化酶的酶活低、生物酶易脱落、操作稳定性低的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种固定化载体，包括磁性纳米颗粒、富羧基复合材料以及过渡金属离子；其中，磁性纳米颗粒平均粒径在5纳米至20纳米之间，富羧基复合材料包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羧基壳，其平均厚度在5纳米至30纳米之间，其表面羧基与过渡金属离子络合，过渡金属离子用于与待固定化的酶通过金属离子配位键结合。

优选地，所述固定化的载体，其磁性纳米颗粒为纳米铁氧化物、纳米钛氧化物或纳米硅氧化物。

优选地，所述固定化的载体，其富羧基复合材料包括三层，从里到外依次为多羟基溶胶-凝胶型化合物、环氧氯丙烷和多羧基化合物。

优选地，所述固定化的载体，其过渡金属离子为Co²⁺、Ni²⁺和/或Mn²⁺，每克载体包含过渡金属离子20微摩尔至100微摩尔。

按照本发明的另一方面，提供了一种固定化载体制备方法，包括以下步骤：

（1）制备磁性纳米颗粒；

（2）对步骤（1）中制备的磁性纳米颗粒进行羟基功能化修饰：将步骤（1）中得到的磁性纳米颗粒和多羟基溶胶-凝胶型化合物均匀分散于有机溶剂中，强力搅拌同时低温凝固，去除有机溶剂，获得包覆有多羟基溶胶-凝胶型化合物的磁性纳米颗粒；

（3）对步骤（2）中制备的包覆有多羟基溶胶-凝胶型化合物的磁性纳米颗粒进行环氧基功能化修饰：将步骤（2）中获得包覆有多羟基溶胶-凝胶型化合物的磁性纳米颗粒，在碱性条件下均匀分散于环氧氯丙烷的惰性有机溶剂溶液中，去除惰性有机溶剂，获得环氧基功能化的磁性纳米颗粒；

（4）对步骤（3）中制备的环氧基功能化的磁性纳米颗粒进行羧基功能化修饰：将步骤（3）中获得的环氧基功能化的磁性纳米颗粒，在碱性还原条件下，与具有氨基残基或亚氨基残基的富羧基化合物共价交联，获得富羧基复合材料包裹的磁性纳米颗粒；

（5）将步骤（4）中获得的磁性纳米颗粒其表面的羧基与过渡金属离子络合，即制得固定化载体。

优选地，所述固定化载体制备方法，其步骤（2）所述的多羟基溶胶-凝胶型化合物为琼脂糖或壳聚糖，所述磁性纳米颗粒与多羟基溶胶-凝胶型化合物超声分散后，采用乳化剂，在65摄氏度下，通过强力搅拌分散于有机溶剂中，所述有机溶剂为甲苯-三氯甲烷溶液，采用磁性分离去除有机溶剂。

优选地，所述固定化载体制备方法，其步骤（3）所述的惰性有机溶剂为二甲基亚砜，采用磁性分离去除有机溶剂。

优选地，所述固定化载体制备方法，其步骤（4）所述的具有氨基残基或亚氨基残基的富羧基化合物为亚氨基二乙酸或氨三乙酸，所述富羧基化合物其氨基残基或亚氨基残基与环氧基功能化的磁性纳米颗粒表面的环氧基发生共价交联反应。