[发明专利]产生O‑乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生O‑乙酰高丝氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸(L-蛋氨酸前体)的微生物株。另外，本发明还涉及利用所述微生物株高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。

背景技术

可以通过化学或生物学方式合成在动物饲料、食品和医药中使用的蛋氨酸。

在化学合成中，蛋氨酸基本上是通过水解5-(β-甲基巯基乙基)乙内酰脲产生的。然而，合成的蛋氨酸的不利之处在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，这需要困难的额外方法将它们彼此分开。为了解决该问题，本发明的发明人开发了用于选择性地合成L-蛋氨酸的生物学方法，L-蛋氨酸是已有专利申请(WO2008/103432)要求保护的化学物质。该方法(简称为“两步法”)包括发酵产生L-蛋氨酸前体和由L-蛋氨酸前体向L-蛋氨酸的酶促转化。所述蛋氨酸前体优选包括O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸。就对常规方法存在的问题的克服对所述两步法进行评价，所述常规方法存在的问题例如硫化物的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反馈调控，以及胱硫醚γ-合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶对中间产物的降解。另外，与产生DL-蛋氨酸的常规化学合成法相比，所述两步法具有以下优点：仅对L-蛋氨酸具有选择性，并且伴随产生作为有用副产物的有机酸，例如琥珀酸和乙酸。

作为蛋氨酸生物合成途径中的中间产物，O-乙酰-高丝氨酸被用作产生蛋氨酸前体(WO2008/013432)。如下式所示，在O-乙酰转移酶的协助下由L-高丝氨酸和乙酰-CoA合成O-乙酰-高丝氨酸：

L-高丝氨酸+乙酰-CoA→O-乙酰-高丝氨酸。

在本申请的受让人的美国专利公开第US2009-0253186A1号中公开了其中引入了thrA和metX基因以分别提高L-高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸的生物合成的微生物株，以及利用所述微生物株高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。关于这一点，本发明的发明人认为增加乙酰-CoA(O-乙酰高丝氨酸的生物合成中使用的两种底物之一)可提高O-乙酰高丝氨酸的产量。

在大肠杆菌中，大部分乙酰-CoA是由丙酮酸合成的。然而，如果存在过量的葡萄糖，可以由培养基中累积的乙酸产生乙酰-CoA。从乙酸合成乙酰-CoA可以利用两种不同的生物合成途径。在一种乙酰-CoA生物合成途径中，存在乙酰腺苷酸(AcAMP)中间产物，而乙酰-CoA合酶(acetyl-CoA synthase，ACS)通过该中间产物将乙酸活化成乙酰-CoA。在另一种途径中，作为由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化的连续反应的结果，通过乙酰磷酸将乙酸转化为乙酰-CoA(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,May1995,p.2878-2886)。在由乙酰-CoA合酶介导的生物合成途径中发挥重要作用的乙酰-CoA合酶对乙酸具有高亲和力，其甚至可以将细胞内或细胞外的低水平乙酸活化成为乙酰-CoA。相比而言，ACK-PTA-介导的乙酰-CoA生物合成途径仅在可能由混合酸的发酵形成的高乙酸水平下进行，因为ACK和PTA酶对乙酸具有低的亲和力(J.Gen.Microbiol.102:327-336)。

对于乙酰-CoA合酶，由于位于启动子上游的CRP-结合位点，其表达在指数生长前在转录水平上受到代谢物阻遏控制的抑制，而此后当细胞进入静止期时，其表达增高(Mol Microbiol.2004Jan;51(1):241-54.)。

因此，可以通过ACK-PTA途径将在发酵中期累积的乙酸活化成乙酰-CoA。然而，由于ACK-PTA途径是可逆的，如果乙酸的水平低，那么乙酰-CoA被转化为乙酸。也就是说，在ACK-PTA途径中可能发生乙酰-CoA的消耗，显示出对O-乙酰高丝氨酸合成的负作用。