[发明专利]一种DNA水凝胶及其在过氧化物检测中的应用

说明书

技术领域： 

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种DNA水凝胶及其在过氧化氢检测中的应用，具体涉及高分子材料DNA水凝胶在肉眼检测过氧化物中的应用。

背景技术：

DNA水凝胶分为纯DNA水凝胶和DNA与人造高分子杂化的DNA水凝胶。本发明仅涉及后者。后者是一种将DNA嵌入到高分子水凝胶中并兼具水凝胶和DNA的特点的功能型的智能水凝胶。

DNA酶（以下简称DNAzyme）是一种具有催化活性的DNA分子，目前在药学，生物学和材料学领域受到广泛研究。本发明所涉及的是具有模拟过氧化酶活性的DNAzyme。这种DNAzyme的寡核苷酸链可自身折叠或分子间以四聚体形式结合形成G四链体的结构。形成G四链体的结构后通过结合血红素（hemin）分子，显示过氧化酶活性，从而催化过氧化酶底物。这种DNAzyme与过氧化蛋白酶相比具有价格低廉，热稳定性好，可重复利用，易于进行分子加工和修饰，可操作性强等优点。

目前检测过氧化物的方法主要有荧光法，化学发光法，高效液相色谱法，电子顺磁共振法和基于酶传感的电化学方法等。但是这些方法都需要借助相应的仪器设备实施，使用起来不便。市场上销售的过氧化氢检测试纸则具有无法重复使用的缺陷。

发明内容：

本发明所解决的技术问题是提供一种可应用于肉眼半定量检测过氧化物的DNA水凝胶。该水凝胶不仅具有可加工性，而且可重复使用。该水凝胶是以具有过氧化酶活性的DNAzyme作为交联剂，聚丙烯酰胺为骨架的新型DNA水凝胶。其结构由下述含有DNA的聚丙烯酰胺高分子(图1)，T-DNAzyme-T，及血红素通过分子间作用力(主要包括氢键, 静电引力,疏水性相互作用等)结合形成。其中T-DNAzyme-T的两端或一端的序列可与DNA的序列互补杂交形成氢键。T-DNAzyme-T内部的序列为已报道的可结合血红素分子的具有过氧化酶活性的DNAzyme序列。T-DNAzyme-T与血红素以1 : 1或2 : 1或4 ：1的比例结合。DNA: T-DNAzyme-T可以是2 : 1或1 : 1。水凝胶中丙烯酰胺单体的质量百分比为3 % ～ 20 %。m与n的比为2000 : 1至10 : 1。

 

本发明采用以下技术方案制备DNA水凝胶：

（一）Acrydite-DNA的合成：

6-氨基-1-己醇和三乙胺混合后冷却到0℃。甲基丙酰胺滴加到反应液中，混合物在0℃下搅拌2 ～ 4小时。反应完之后将溶剂蒸出。残留物溶于乙醇和15 %的氢氧化钠的混合溶液中。溶液反应2 ～ 4小时，得到6-羟己基甲基丙烯酰胺。将6-羟己基甲基丙烯酰胺溶于二氯甲烷（CH₂Cl₂）中，搅拌并缓慢加入N,N’-二异丙基乙胺（DIPEA），反应保持0℃。然后2-羟乙基-二异丙胺-氯代亚磷酰胺缓慢滴加到反应液中，保持0℃反应 3 ～ 6小时。然后将溶剂除去。残留物溶于乙酸乙酯中，并用饱和氯化钠萃取。除去溶剂后，产物用柱层析分离（乙酸乙酯：石油醚=5 : 1）得到无色油状液体，即3-氰乙基-二异丙基-6-甲基丙烯酰胺基亚磷酰胺（Acrydite）。通过DNA合成仪将Acrydite接入到DNA的5’端，得到Acrydite-DNA。

（二）以DNAzyme为交联剂的聚丙烯酰胺水凝胶的制备

首先，将T-DNAzyme-T加入到离心管中，加入缓冲液A（50mM 吗啉乙磺酸；100mM Tris-醋酸；40mM 醋酸钾；1% N,N-二甲基亚砜；0.05% 曲拉通X-100，PH 6.5）， 经变性退火形成G-四链体，加入血红素，并混匀，形成G-四链体-血红素复合物。该复合物具有过氧化酶活性，即DNAzyme。其次，将丙烯酰胺和Acrydite-DNA混合，加入过硫酸铵（APS）和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）聚合形成含有DNA序列的DNA聚丙烯酰胺链。最后 DNAzyme与该DNA聚丙烯酰胺链通过DNA互补序列分子杂交交联形成DNA水凝胶。

利用本发明制得的DNA水凝胶如图3所示。从图3照片可以看出，该方法得到的凝胶呈现凝胶态（图3a），与未添加DNAzyme的DNA聚丙烯酰胺链溶液（图3b）有明显区别。图3a中水凝胶的颜色来源于血红素。

所述的DNA序列为：　　

DNA:          5’-AAA AAA AAA AAA AAA A-3’