[发明专利]一种表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蚕重组杆状病毒的纯化方法

说明书

本发明提供一种表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蚕重组杆状病毒的纯化方法，它以感染了重组杆状病毒NPV‑gp64‑HA的蚕蛹为原料，与无菌水进行混合后进行匀浆，取匀浆液低速离心，取低速离心的稠状溶液高速离心，取高速离心的上清用0.1μm膜包超滤，取截留液超速离心，得到黑团用超滤液重悬过夜，蔗糖密度梯度离心，然后取区带后活性高的样品，300KD膜包超滤，0.22μm滤膜过滤，收集截留液，获得表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的病毒粒子。该方法可以获得具有较纯的在家蚕杆状病毒表面展示有禽流感H5N1HA蛋白的病毒粒子。

技术领域

本发明涉及病毒纯化技术领域，具体涉及一种表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白（75KD）的家蚕重组杆状病毒的纯化方法。

背景技术

杆状病毒基因组为130kb左右，因此可以容纳较大的外源DNA片段。病毒基因组中多角体蛋白基因是病毒感染晚期高效表达的基因，却是病毒复制增殖的非必需区，因此适于插入外源基因的多拷贝。该基因受强启动子调控，可较高水平表达外源蛋白。外源DNA插入多角体蛋白基因内，使此基因功能丧失，不能再合成多角体蛋白。而野生型病毒多角体蛋白基因表达出大量产物形成包涵体，筛选时极易将之与重组病毒区别开来。另外，杆状病毒表面展示系统能够完成翻译后蛋白质的加工修饰，使外源产物具有较高生物学活性。

本申请人构建了重组家蚕杆状病毒，将H5N1型流感病毒表面HA蛋白与杆状病毒囊膜表面gp64蛋白在家蚕细胞中融合表达，其定位于受重组杆状病毒感染的家蚕细胞膜表面。当杆状病毒通过出芽方式从细胞释放出来时，大部分病毒会形成带有融合蛋白的病毒包膜。这样，通过筛选就可以鉴定出表面展示有目的蛋白（HA蛋白）的重组杆状病毒。

纯化病毒的方法主要有沉淀法、离心法和透析法等。目前病毒粒子的纯化大多用离心法，较常使用的梯度材料有蔗糖、甘油、氯化铯和重水等。现有的表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蚕重组杆状病毒粒子的纯化方法，存在步骤复杂繁琐，成本较高，纯化效率低等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种新的表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蚕重组杆状病毒的纯化方法，该方法主要依据HA蛋白和病毒粒子分子量大小，通过简单的匀浆，低速离心，高速离心，超速离心超滤和过滤方法，获得具有较纯的在家蚕杆状病毒表面展示有禽流感H5N1HA蛋白的病毒粒子。

本发明所采用的技术方案为：

一种表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蚕重组杆状病毒的纯化方法，它以感染了重组杆状病毒NPV-gp64-HA的蚕蛹为原料，与无菌水进行混合后进行匀浆，取匀浆液低速离心，取低速离心的稠状溶液高速离心，取高速离心的上清用0.1μm膜包超滤，取截留液超速离心，得到黑团用超滤液重悬过夜，蔗糖密度梯度离心，然后取区带后活性高的样品，300KD膜包超滤，0.22μm滤膜过滤，收集截留液，获得表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的病毒粒子。

作为优选，所述蚕蛹与无菌水混合的质量比为1：3。

作为优选，所述低速离心在20℃的温度条件下进行；所述高速离心在4℃的温度条件下进行；所述超速离心在10℃的温度条件下进行。

作为优选，所述低速离心速率为8000rpm；所述高速离心的速率为15000rpm；所述超速离心的速率为50000rpm；所述蔗糖密度梯度离心的速率为35000rpm。

作为优选，所述蔗糖密度梯度离心所用蔗糖密度为30%蔗糖、55%蔗糖。所用试剂PB：NaCl85.0g、Na₂HPO₄70.0g、NaH₂PO₄3.4g、EDTA4.0g倒入装有纯化水的5L烧杯中，溶解后用1L量筒定容至1L。

作为优选，所述区带后活性高的样品在超滤之前，用1：4000的β-丙内酯，4℃灭活24小时，37℃水解4小时。