[发明专利]一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒的表达载体构建方法，尤其涉及一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

中国的柑桔种植面积和产量均居世界第一。柑桔衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）引起的柑桔衰退病是一种重要的世界性柑桔病害，通过蚜虫和带病苗木传播。我国广泛分布柑桔衰退病毒的多种强毒株和强力传媒褐色桔蚜，随着20世纪80年代末进行柑桔产业结构调整，柚类和甜橙的种植比例增加，柑桔衰退病对柚类和某些甜橙的为害加剧。

随着分子生物学技术的发展，农杆菌表达载体和植物病毒载体是当前表达外源基因的两种主要途径载体。与农杆菌表达载体相比，植物病毒载体具有寄主范围广、表达效率高等优点，且大多数植物病毒可通过机械接种进行传播，适于大规模商业操作，除用于获得大量、优质的外源重组蛋白外，植物病毒载体也是反向遗传学中研究基因功能，以及基因沉默现象等的重要工具。由于目前研究中主要使用的基于草本植物病毒的表达载体不能侵染果树，且其稳定性较差，容易丢失插入的外源基因，因此该类载体无法满足果树研究的需要。

绿色荧光蛋白（GFP）也越来越多的被作为基因表达的标记物用于科研的各个领域，其产物GFP对细胞无毒性，且检测简单，不用任何底物或者其他辅助物即可以在荧光显微镜下直接观察到荧光，极大地方便了基因表达水平的检测与定位等。

发明内容

针对我国现有基于果树病毒的表达载体研究不足的问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法。

本发明所提供的柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，包括以下步骤：

1）提取病株中柑桔衰退病毒的总RNA；

2）以上述总RNA为模板，用引物ZYC357/ZYC358扩增启动子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分别扩增柑桔衰退病毒基因组的片段1和片段2，所述的引物核苷酸序列分别为：

ZYC357：5’-TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA AAGGAGAAGAACT-3’

ZYC358：5’-ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A-3’

ZYC412：5’-GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3’

ZYC415：5’-CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3’

ZYC479：5’-CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’

ZYC480：5’-ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’

3）用含有绿色荧光蛋白的质粒和特异引物ZYC349/ZYC350扩增绿色荧光蛋白基因，引物ZYC349/ZYC350序列为：

ZYC349：5’-AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3’

ZYC350：5’-AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3’

4）将步骤2、3中获得的启动子、片段1、片段2和绿色荧光蛋白基因的扩增产物经切胶纯化后，分别与载体进行链接、转化，并对获得的菌液进行质粒纯化；

5）取步骤4中的纯化后分别含启动子和片段2的质粒混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC358，从而得到35S-127，并进行浓缩；将纯化后分别含片段1和绿色荧光蛋白基因的质粒进行混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC349/415，从而得到35S-126；将浓缩后的35S-126和35S-127混合，再次通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC415，从而得到35S-128，并进行浓缩；

6）取步骤5中所述浓缩后的35S-128与柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148分别进行StuI/PacI双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶回收，纯化后的酶切产物混合并进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后从而得到柑桔衰退病毒的表达载体35S-149。