[发明专利]一种转基因毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

    本发明涉及一种基因工程菌，具体涉及一种转基因毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

胶原是哺乳动物体内含量最高（约占体内总蛋白含量的25%）、作用最为广泛的一类大分子蛋白，胶原作为细胞外基质的主要成分在细胞分化、迁移等生理行为中起重要作用。随着组织工程科学的不断发展，以及再生医学研究的不断进步，胶原的应用愈加广泛。重组胶原蛋白由于其产品质量均一、无病毒性隐患和过敏性反应，且易于规模化生产等特点，将逐渐替代天然胶原成为组织工程研究的重要材料。

目前，国外已经实现三螺旋胶原蛋白的表达，其表达系统有动物表达系统，植物表达系统和微生物表达系统。微生物系统对于生产重组胶原蛋白和重组明胶来说，有着低成本、产品质量均一、高效可放大的优势。目前用于重组表达人胶原蛋白或明胶的宿主菌有毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、大肠杆菌与短杆菌。但对于胶原和明胶，毕赤酵母是最优的生产系统。毕赤酵母的重组菌可以在胞内产生羟基化的三螺旋重组人胶原可达到1.5g/L。与重组胶原共表达脯氨酸羟化酶可以合成与天然胶原相似的热稳定性的羟基化胶原。纯化得到的羟基化重组胶原纤维在结构上与天然胶原相同。这些质量可以使重组胶原的医学用途更加有吸引力。国外研究结果表明，毕赤酵母分泌重组胶原或明胶产量达到3-14g/L。早在20世纪90年代，芬兰大学在酵母中多基因共表达前胶原与脯氨酸羟化酶，获得了重组三螺旋胶原。美国Fibrogen公司也实现了胶原的三螺旋结构表达并申请了专利，他们通过共表达羟基化酶对胶原肽链Pro进行修饰，细胞破碎提取并纯化胶原单链，在体外创造自组装环境，进而形成三螺旋胶原。

天然胶原得重组表达在国内至今没有相关的研究，但都集中在表达类人胶原和明胶片段的研究上。西北大学范代娣用大肠杆菌表达自行设计的类人胶原，产量稳定且高达20g/L；华澳利康采用毕赤酵母表达胶原蛋白融合肽也取得一定的进展，南京理工大学也在进行相关方面的研究等。

由于天然三螺旋胶原的重组表达，工艺极其复杂，并且很难实现其规模化生产，因此重组表达天然胶原单链和明胶片段不失为理想的选择。分泌全长胶原单链虽然有相关方面的研究，但都不能有效克服其易降解的缺点，且实验室研究较多，未规模化生产。

为了充分发挥人I型胶原蛋白在生物医用材料中的作用，实现该蛋白的大规模产业化应用，首先要实现该蛋白的大量、稳定的表达，并可以分泌到胞外。由于市场上存在的胶原产品，多是从动物中提取的胶原，从而存在病毒性隐患以及产品质量不均一等问题，限制了其在生物医用材料中的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用，能高效、安全地进行I型胶原α1链蛋白的胞外分泌表达。

本发明所采用的技术方案是：

一种转基因毕赤酵母基因工程菌，其特征在于：

所述的基因工程菌于2013年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7981。

所述的基因工程菌是对从人胎盘组织中克隆出的人I型胶原α1链基因Col1a1进行改造后，与表达载体pPIC9K载体连接，导入毕赤酵母菌SMD1168中构建而成的基因工程菌。

一种转基因毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：从人胎盘组织中克隆出I型胶原α1链基因Col1a1；

步骤二：对I型胶原α1链基因Col1a1涉及XhoI酶切位点的碱基进行突变改造；

步骤三：将改造后的I型胶原α1链基因Col1a1与表达载体pPIC9K载体连接，构建出表达质粒pPIC9K-Col1a1；

步骤四：将构建的表达质粒pPIC9K-Col1a1酶切线性化后，导入毕赤酵母菌SMD1168中；

步骤五：测定I型胶原α1链基因Col1a1转化进入了毕赤酵母菌SMD1168中，从而得到转基因毕赤酵母工程菌。

步骤二得到的改造后的Col1a1基因序列为SEQ ID No.1。

所述的一种转基因毕赤酵母基因工程菌在I型胶原α1链蛋白高效表达中的应用。

所表达的I型胶原α1链蛋白Col1a1，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

本发明具有以下优点：