[发明专利]一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，属于干细胞培养技术领域。

背景技术

近年来，随着干细胞的研究不断深入，其在疾病治疗应用价值也被不断发现和证实。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类来源于发育早期的中胚层和外胚层的成体干细胞，是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。MSCs可来源于骨髓、脂肪、脐带血、真皮、胎盘等组织；此外与其他干细胞相比，MSCs容易提取分离、增殖以及基因导入，所以其在细胞移植治疗和基因治疗中有很大的优势。同时MSCs具有多向分化的潜能，能够诱导分化为许多不同的组织，归巢特性，以及免疫调节作用，对于组织修复和免疫疾病等的治疗有很大的作用。已有不少文献证实了MSCs对肝脏疾病积极的治疗作用。

然而，MSCs的细胞治疗应用依然存在一些问题：

（1）MSCs的血清培养存在潜在的安全风险。血清成分不明确，其中可能含有动物携带的已知的或未知的病原体, 在临床应用中具有潜在的危险；

（2）需更多动物实验研究证实MSCs移植治疗的有效性和安全性。虽有一些MSCs移植治疗的临床案例，但数量少，且缺少对照。

（3）利用人MSCs作为研究对象，存在取材不便及安全伦理道德的问题。

发明内容

为了克服现有技术中血清培养所存在的安全性、有效性等方面的因素，本发明提供一种无血清方式的骨髓间充质干细胞培养方法。

一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，以MSC SFM为基础培养基，在该基础培养基中添加细胞外基质和细胞因子，将骨髓细胞悬液离心后，在上述培养基中，37℃情况下，以1′10⁴ /cm²细胞密度进行恒温接种培养。

进一步的，作为优选：

所述的细胞外基质包括Cell start和Fibronectin，细胞因子为10μg/L bFGF。

所述的MSC SFM为99%MSC SFM +1%Supplement+双抗。

所述的细胞外基质Cell start使用前先以1:1000的浓度稀释于α-MEM，置37℃培养箱沉淀，实验前吸去上清液，晾干备用。

其中，MSC SFM为商品化的试剂，公司：invitrogen, 目录号：A10675-01；产品全称：StemPro^? MSC SFM XenoFree。

Cell start：公司：invitrogen,目录号：A10142；产品全称：CELLstart^TMCTS^TM substrate。

bFGF：碱性成纤维生长因子。

α-MEM：一种基础培养基。

Fibronectin：纤维连接蛋白。

本发明以StemPro^? MSC SFM作为基础培养基，这种无血清培养的细胞个体及集落形态与有血清培养的具有很大的相似性，但也存在差异，其原理、有益效果以及与有血清培养的差异主要如下：

1. 有血清和无血清培养的MSCs单个细胞均呈典型的梭性，集落呈菊花状或漩涡状，与典型的MSCs细胞形态和集落特性相符合。血清培养的MSCs贴壁时细胞形态狭长，铺展较开，在增殖过程中由于细胞数量及紧密度的增加使得个体细胞形态逐渐收缩变短小，集落中各细胞连接紧密；无血清培养的MSCs在贴壁时细胞形态短小，铺展程度不高，而在增殖过程中逐渐铺展开，随着细胞数量的增加，细胞形态逐渐变得狭长，在集落中细胞与细胞间连接不紧密。这些差异性可能是由于培养基的不同造成的，但并不影响MSCs的基本生物学特性。

2. 无血清培养培养体系保持了MSCs的干性特征：具有典型的MSCs细胞和集落形态，表型特征，及具有脂肪，成骨，软骨的分化潜能。采用脂肪、成骨、软骨分化培养液对无血清体外扩增的MSCs进行分化培养，并取分化后细胞RNA进行各分化标志基因（Ppar、RUNX2、SOX9）及干性标志基因（CD29、CD44）的荧光定量分析，结果显示，无血清体外培养的MSCs也具有向脂肪、成骨、软骨分化的能力，在分化的过程中，各分化标志基因的表达能力逐渐增强，干性标志基因的表达能力逐渐减弱。

3. 基于上述两点，无血清培养方式解决了常规有血清培养所存在的安全性、有效性的问题，采用本发明无血清培养方式，取材更方便，也更符合人性化和伦理道德对细胞培养的要求。

附图说明