[发明专利]一种β-内切葡聚糖酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体是一种β-内切葡聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

在当前世界粮食危机和能源危机的背景下，纤维素乙醇等新能源技术被愈发重视。作为最丰富的可再生资源之一，每年由光合作用产生的纤维素可达到1000亿吨。发展纤维素降解技术，将农林废弃物转化为能源或者工业原料是全球关注的热点。对于纤维素乙醇的生产，木质纤维素的糖化水解是最关键的一步，占到了整个纤维素乙醇生产成本的一半以上，而木质纤维素的糖化水解主要依赖于纤维素降解酶。当前，降低用酶成本，提高还原糖得率及纤维素转化率成为研究的主要目标。

β-内切葡聚糖酶是纤维素酶系中的一个重要组成成分，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。而在木质纤维素糖化水解过程中，底物一般要经过高温预处理，而且纤维素酶参与的反应一般都是在较高的温度条件下，所以寻找耐高温的β-内切葡聚糖酶对于木质纤维素的糖化水解走向工业化应用具有重要意义。

定向进化是蛋白质工程中常用的一种蛋白改造方法，可以在对蛋白质结构和功能信息不清楚的情况下对目的蛋白进行改造，使用高通量筛选方法找出性能改善的突变体，进行多轮的突变和筛选，可以进一步提高蛋白质的性能。定向进化这种改造策略对于提高蛋白质的耐热性显示出了巨大的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-内切葡聚糖酶突变体及其应用。本发明通过对来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens）的β-内切葡聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，与野生型相比，突变体的耐热性得到显著提高，从而有利于实现其在纤维素糖化水解中的广泛应用。

申请人对斜卧青霉β-内切葡聚糖酶利用定向进化技术进行分子改造，经过大量的筛选，发现V56I和D212N这两个突变位点能引起β-内切葡聚糖酶耐热性的改变，从而促成本发明。

本发明一方面提供了一种β-内切葡聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-内切葡聚糖酶的第56位氨基酸由Val变为Ile，第212位氨基酸由Asp变为Asn。

上述β-内切葡聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：4的β-内切葡聚糖酶突变体基因的表达载体。

本发明还提供携带上述表达载体的里氏木霉（Trichoderma reesei）工程菌株。

本发明通过定向进化技术获得了一种β-内切葡聚糖酶突变体，并构建得到重组表达该突变体的里氏木霉工程菌株。所述突变体的最适作用温度为65℃，且在60-70℃范围内能保持80%以上的酶活；所述突变体在75℃条件下处理5min，仍能保持40%以上的酶活，80℃条件下处理2min，能保持50%以上的酶活，与野生型相比，突变体的耐热性得到显著提升。本发明所述里氏木霉工程菌能高效重组表达突变体蛋白，20L发酵罐发酵酶活高达7120U/mL，比野生型提高了50.5%。本发明获得的β-内切葡聚糖酶突变体能显著提高木质纤维素的糖化率，且在高温条件下酶解效果显著优于野生型，更适合于纤维素转糖工业化生产条件，能大幅度降低用酶成本，从而降低生产成本，有利于β-内切葡聚糖酶突变体在纤维素转糖工业中的广泛应用。

附图说明

图1：β-内切葡聚糖酶突变体GluM15与野生型Glu98最适作用温度比较图；

图2：β-内切葡聚糖酶突变体GluM15与野生型Glu98的耐热性比较图。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1β-内切葡聚糖酶突变体基因的合成及扩增

为了提高来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens）的β-内切葡聚糖酶（命名为Glu98，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，基因序列为SEQ ID NO:2）的耐热性，申请人使用定向进化技术获得了数目较多的该酶的突变体，然后对突变体进行了筛选。

设计PCR引物Glu98-F、Glu98-R如下：