[发明专利]具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱的合成及其药物组合物

权利要求书

1.一种具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于：所述昆布氨酸缩丙醛希夫碱的合成方法为：将40mmol(2.88g)丙醛用10mL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有40mmol(7.56g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中；滴加完毕后温度缓慢升至70℃，继续反应4小时；蒸发溶液至余下约5mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成；将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得白色目标产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。

2.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于：所述双昆布氨酸缩乙二醛希夫碱的合成方法为：将40mmol(2.32g)乙二醛用10mL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有80mmol(15.12g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中；滴加完毕后温度缓慢升至70℃，继续反应4小时；蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成；将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得微黄色目标产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。

3.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于：所述昆布氨酸缩3,5-二溴水杨醛希夫碱的合成方法为：按权1所示方法合成，将方法中的丙醛用3,5-二溴水杨醛代替，获得预期产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。

4.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于：所述昆布氨酸缩2-羟基-1-萘醛希夫碱的合成方法为：按权1所示方法合成，将方法中的丙醛用2-羟基-1-萘醛代替，获得预期产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，易溶于水。

5.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于：所述昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱的合成方法为：按权1所示方法合成，将方法中的丙醛用2-吡啶甲醛代替，获得预期产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，易溶于水。

6.根据权利要求1至5所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于：针对上述化合物进行药理学分析研究，具体包括：

(1)化合物与DNA相互作用的研究：

上述化合物与DNA相互作用能力研究，应用鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)作为研究对象；鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)用NaCl/Tris-HCl(pH＝7.16)缓冲溶液配制成10^-4M的溶液，测量260nm和280nm处的吸光度(A)，A260/A280在1.8～1.9的范围内，说明HS-DNA溶液符合实验要求；测量HS-DNA在260nm处的吸光度，根据朗姆-比尔定律计算DNA的浓度(以DNA碱基对的摩尔浓度计，ε260＝6600L·mol^-1·cm^-1)；

紫外吸收光谱滴定：化合物用NaCl/Tris-HCl缓冲溶液配成10^-3M的溶液，然后稀释到10^-5M的浓度；以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照液，测定200～800nm波长范围内的紫外光谱；每次加样，分别向空白和配体样品中加入等量配制好的HS-DNA溶液(10^-3M)，充分混合然后静止10min后再进行扫描；键合常数由以下公式确定：

[DNA]/(ε_a-ε_f)＝[DNA]/(ε_a-ε_f)+1/K_b(ε_a-ε_f)

其中[DNA]代表DNA的浓度，ε_a，ε_f和ε_b分别代表在各DNA浓度下的、游离的和与DNA键合饱和的配体的摩尔吸光系数；以[DNA]/(ε_a-ε_f)对[DNA]作图，键合常数K_b为直线的斜率和截距之比；

荧光猝灭光谱滴定：EB-DNA复合体系的配制：将5μL EB(1×10^-3mol·L^-1)溶液加入到1mL HS-DNA(10^-3M)溶液中置于10mL比色管中，常温下避光保存2h；然后加入NaCl/Tris-HCl缓冲溶液稀释至5mL，混合均匀后；以522nm的波长激发，记录EB-DNA复合体系在584nm处的荧光发射波长及强度；每次加样，向样品中加入等量配制好的配体样品溶液(10^-3M)，记录不同浓度配体对EB-DNA复合体系的荧光猝灭光谱；猝灭系数由Stern-Volmer公式确定：

I₀/I＝1+K_sv[Q]

其中I₀和I分别代表不加化合物和加化合物时EB-DNA复合体系的的荧光强度；[Q]表示猝灭剂(化合物)的浓度；以I₀/I对[Q]作图，斜率即为猝灭常数K_sv；

(2)化合物与BSA相互作用的研究：

上述化合物与蛋白相互作用能力研究，应用牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象；紫外吸收光谱滴定：将配制好的BSA储备液(100μM)稀释到10μM，以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照，测定200～350nm波长范围内的紫外光谱，每次加样分别向空白和BSA样品中加入等量配制好的化合物溶液(10^-3M)，充分混合然后静止10min后再进行扫描；

色氨酸荧光猝灭光谱滴定：将配制好的BSA储备液(100μM)稀释到10μM，以295nm的波长激发，记录BSA溶液在584nm处的荧光发射波长及强度；每次加样，向样品中加入等量配制好的化合物样品溶液(10^-3M)，记录不同浓度化合物对BSA溶液的荧光猝灭光谱；猝灭系数由Stern-Volmer公式确定：

I₀/I＝1+K_sv[Q]＝1+K_qτ₀[Q]

其中I₀和I分别代表不加化合物(配合物)和加化合物(配合物)时的荧光强度；[Q]表示化合物(配合物)的浓度；K_sv为动态猝灭常数；K_q为动态猝灭速率常数；τ₀为无猝灭剂是荧光分子的平均寿命(10^-8s^-1)；以I₀/I对[Q]作图，斜率即为K_sv；各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×10¹⁰L·mol^-1·s^-1；通过K_sv＝K_qτ₀，求得K_q；

在静态猝灭过程中，假设在生物大分子上有两到三个相似又彼此独立的结合位点，则荧光强度与猝灭剂之间的关系可表示为公式：

nQ+B→Q_n...B

其中B表示发荧光的生物大分子，Q是猝灭剂分子，Q_n...B表示生成的无荧光强度的生物分子，其生成常数可表示为：

K＝[Q_n...B]/[Q]n[B]

如果生物大分子的总浓度为B₀，则[B₀]＝[Q_n...B]+[B]，[B]表示未结合的生物大分子的浓度，则荧光强度和未结合的生物大分子的浓度的关系为[B]/[B₀]＝F/F₀，F₀和F分别表示未加猝灭剂和加入猝灭剂时生物大分子的荧光强度；从以上关系中可推出公式：

log[(F₀-F)/F]＝logK+nlog[Q]

其中K表示猝灭剂和生物大分子的结合常数，n表示猝灭剂和生物大分子的结合位点数，以log[(F₀-F)/F]对log[Q]作图，斜率即为n，由截据求得结合常数K；

(3)上述化合物的体外细胞毒试验使用SRB检测法，测定了加入上述合成的化合物后，培养基在515nm处的OD读数，由测得的OD值，通过如下公式计算待测样品对人肝癌细胞株(SMMC-7721)、肺腺癌细胞株(A549)细胞、人急性早幼粒白血病(HL-60)和正常小鼠角质细胞(Pam212)的抑制率：

以被测样品浓度对抑制率做线性回归，求出其48h内的半数抑制浓度(IC₅₀)；以顺铂作为阳性对照。