[发明专利]胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于妇产科学领域，涉及胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用。

背景技术

子宫内膜严重损伤时内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫前后壁发生纤维化，瘢痕形成，临床上主要表现为宫腔粘连、闭经及子宫性不孕等，目前尚无有效治疗方法。

在本发明之前，对于严重子宫内膜损伤的治疗方法如下：

1、临床上通用方法是宫腔镜手术机械性分离宫腔粘连，术后放置宫内节育器或防粘连材料(主要是透明质酸、Intercoat gel)等，并于术后给予雌激素促进内膜生长。但对子宫内膜严重损伤，无法解决内膜疤痕问题，不能实现内膜功能性修复，且极易发再次粘连。

2、最近有小样本研究报道，宫腔粘连分离后用人新鲜羊膜覆盖创面，该法不能诱导疤痕内膜自身功能性修复，且羊膜还存在免疫炎症和诱发感染等风险。

3、子宫腔灌注粒细胞集落刺激因子，据报道可使部分内膜薄的患者内膜厚度增加，但此法不能保留粒细胞集落刺激因子在局部，作用时间短，局部疗效差，也无法达到促进疤痕内膜生长的效果。

4、骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells BMSCs)在刮宫术后将骨髓间充质干细胞均匀地注射到子宫腔内，术后给予激素替代治疗，能增加患者子宫内膜厚度。但BMSCs局部注射后很难在损伤局部定位，影响疗效。

胶原是细胞外基质的主要成分，其具有来源广泛、生物相容性良好、可降解、制备工艺简单等优点，胶原支架(图1)已经CFDA批准应用于临床皮肤及口腔黏膜修复中。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供胶原支架复合骨髓间充质干细胞在治疗严重子宫内膜损伤中的应用。

本发明的技术方案是：

胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法，其主要技术特征在于将BMSCs与胶原支架复合培养；所述复合培养步骤包括：

(1)将BMSCs胰酶消化后制备单细胞悬液；

(2)取单细胞悬液均匀滴加到胶原支架上：

(3)放入培养箱中培养；

(4)加入L-DMEM完全培养基继续培养即得胶原支架复合骨髓间充质干细胞。

所述步骤(2)中，单细胞悬液细胞数量约1×10⁶／cm²。

所述步骤(3)中，培养箱为37℃、5％CO₂培养箱，培养15min。

所述步骤(4)中，加入L-DMEM完全培养基继续培养时间为1h。

胶原支架复合骨髓间充质干细胞可以应用于治疗严重子宫内膜损伤。

所述的严重子宫内膜损伤是指各种原因造成的子宫内膜过度损伤，内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫壁发生纤维化，瘢痕形成。

所述胶原支架由烟台正海生物技术有限公司提供，已经CFDA批准应用于皮肤及口腔黏膜修复。

所述骨髓间充质干细胞由发明人分离与培养，经流式细胞术细胞表面抗原鉴定(图2)及体外诱导分化鉴定(图3)：CD90、CD44、CD29阳性，CD45、CD34阴性，可诱导分化为骨、脂肪及神经元细胞。

所述胶原支架复合骨髓间充质干细胞由以下方法制备：

培养基湿润胶原支架排气后将BMSCs细胞悬液均匀滴加到胶原支架上(约1×10⁶／cm²)，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养15min，加入L-DMEM完全培养基继续培养1h。

本发明治疗严重子宫内膜损伤与以往治疗方法相比，具有以下优点：BMSCs作为治疗严重子宫内膜损伤的活性成分，具有获取方便的优点，其可以补充局部干细胞数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节等作用。胶原支架具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。其可以为BMSCs提供支持位点，提高局部BMSCs浓度，延长BMSCs作用时间。胶原支架复合BMSCs可以促进疤痕子宫内膜修复，增加内膜厚度及局部血管密度。

附图说明

图1——胶原支架外观及扫描电镜图片示意图。

图2——流式细胞术BMSCs表面标志测定示意图。

图3——BMSCs体外定向诱导分化结果示意图。

图4——HE染色观察BMSCs与胶原支架复合后其在胶原支架中的分布示意图。

图5——扫描电镜观察BMSCs与胶原支架复合后其在胶原支架表面分布示意图。