[发明专利]具有体内示踪和肿瘤治疗作用的间充质干细胞及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，涉及一种具有体内示踪和肿瘤治疗作用的细胞。

背景技术

目前，乳腺癌已经成为全世界女性发病率最高的恶性肿瘤之一，严重地威胁着女性的身心健康。在当今技术条件下，其原发肿瘤病灶可以通过手术进行根治，但是手术给患者带来极大的痛苦。目前多应用化疗进行治疗，大多数化疗药物并不能够特异性地作用于肿瘤细胞，在对肿瘤细胞进行杀伤的同时也会对正常细胞产生一定杀伤作用，从而产生毒副作用，往往并不能获得长期生存，且花费巨大。找到一种能够靶向多发的肿瘤病灶部位的载体，将抗癌药物或基因特异性运输到肿瘤病灶，而不对周围的正常组织造成影响将显著提高治疗效果，减低副作用。近年来有研究应用骨髓、胚胎或脐带中分离得到的内皮细胞前体细胞进行试验性地肿瘤靶向治疗，虽然被证实具有一定的有效性，但这类内皮前体细胞来源有限且不易获得，难以应用于临床。人脐带来源的间充质干细胞具有自我更新和分化的能力，其在体外能够进行扩增，如果能够被证实具有肿瘤靶向性，将对应用于临床治疗具有重要意义。同时，为了观测肿瘤的生长情况，并监测载体细胞在体内的分布、增殖和机体排斥的过程，可以应用体内分子成像技术，其具有微创、直观、动态观察的特点，并能够对同一只动物在不同时间点进行监测，能够很好地评估靶向治疗的疗效。

发明内容

本发明的目的在于解决目前应用于试验性肿瘤靶向治疗的临床局限性，提供一种具有能够进行体内示踪并具有肿瘤治疗作用的转基因细胞以及制备方法。

本发明提供的具有体内示踪和肿瘤治疗作用的融合细胞，是由人脐带来源的间充质干细胞、经携带有海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和胸苷激酶的三融合基因的慢病毒表达载体转染后构建而成，该细胞能够进行体内示踪，并在给予胸苷激酶底物更昔洛韦后诱导融合细胞的凋亡。

本发明所涉及的细胞的制备和肿瘤靶向治疗、体内示踪的方法通过以下步骤实现：

1、本发明所述的具有肿瘤治疗作用并且能够进行体内示踪的转基因细胞的制备方法，其具体步骤为：

第1、构建含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd抗性的慢病毒表达载体；

第2、用293T细胞铺六孔板，密度为1.5×10⁶细胞/孔，用于转染；

第3、用Lipo-2000将第1步中构建的三融合基因慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒转染入第2步前铺板的293T细胞；

第4、第3步293T细胞转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于-80℃冰箱备用；

第5、用人脐带来源的间充质干细胞铺六孔板，密度为1×10⁵细胞/孔，用于病毒感染；

第6、待第4步中的病毒上清常温化冻后，混合2毫升不含抗生素的全培养基和1毫升第4步中的病毒上清加入间充质干细胞孔内，并加入Polybrene 24μg/孔，1600rpm，37℃离心1小时；

第7、离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37℃培养箱进行培养；

第8、48小时后向经病毒感染后的间充质干细胞加入Bsd进行药筛共计3天，以得到稳定表达海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，即转基因间充质干细胞。

2、体内肿瘤靶向治疗：

⑴用胰酶消化生长良好的野生型或标记萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培养基重悬至1×10⁷细胞/毫升；

⑵对6-8周龄雌性Nude小鼠腹部两侧分别经原位注射100微升上述肿瘤细胞悬液，待2周后，腹部形成肿瘤灶，建成Nude小鼠乳腺癌模型；

⑶用胰酶消化携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，用PBS洗一遍并用DMEM/F12基本培养基重悬至1×10⁷细胞/毫升；

⑷经瘤内向乳腺癌模型Nude小鼠每侧肿瘤注射100微升上述间充质干细胞悬液；

⑸经腹腔注射更昔洛韦0.5mg，每日2次，两次给药中间间隔12小时，连续4天；

⑹重复上述步骤⑷-⑸4次。

3、体内化学发光成像：

⑴监测肿瘤病灶生长情况：向乳腺癌模型Nude小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒；