[发明专利]过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种可以过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法及其应用

背景技术

衰老是人类生命过程的必然规律，但自古以来，长命百岁、青春永驻就是人们梦寐以求的美好愿望，也是当今人类共同关心的问题。抗衰老研究也成为21世纪生理科学中的热点课题。随着人体的衰老，各项机能的退化是不可避免的，如何全面有效提高人体机能进而延缓衰老进程，是目前研究的热点。

干细胞在抗衰老领域的应用正开展得如火如荼。科学家证实于细胞内含有几十种人体细胞代谢促分化酶，提高人体的抗氧化能力，维持活细胞数量和死亡的平衡，继而实现细胞的养生，从而延缓脏器的衰老，也可能通过改善血供等途径而改善宿主的间质结构，从而为受体的支架细胞服务，延缓机体的衰老过程。

间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，是目前免疫治疗及抗衰老研究的热点。

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是富含半胱氨酸的短肽，对多种重金属有高度亲和性。它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。有许多研究表明，MT在清除自由基与抗氧化的同时，通过对机体超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胧甘肤过氧化物酶(GSH一Px)等活性的提高，可明显增强机体的抗衰老能力(MeydaniM，1998)。

由于MT具有十分重要的生理学功能，因此如何开发利用MT已成为当前研究的热点课题。目前国内开展了多项关于MT的研究，在癌症治疗、细胞抗药性等方面取得了显著的成果。现有技术中有将MT运用腺病毒转基因技术过表达在人脐带间充质干细胞上，进行除铅治疗，并有一定的疗效。但该技术没有解决其取材的便利性、细胞含量及扩增能力等方面存在的缺陷。

所以我们亟需一种方法，使其既能克服以上所述的劣势，又能对人体多方面进行综合性改善，提高整体机能，进而有效延缓衰老。

发明内容

本发明采用腺相关病毒转基因技术使脂肪间充质干细胞（humanadipose-derivedstemcells，hASCs）过表达MT，再将MT-hADSCs细胞输入动物模型体内，从而达到综合性的延缓衰老效果。腺相关病毒不会整合到宿主细胞基因组，方法安全可靠。

采用的技术方案为：

过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法，包括步骤：

A）hASCs的获取、纯化及扩增；

B）携带MT基因的腺相关病毒载体的构建；

C）重组腺相关病毒载体感染hASCs，得到MT-hASCs。

本发明采用腺相关病毒的高效感染可以提高hASCs细胞中MT的表达效率。hASCs细胞来源广泛、细胞含量高、取材容易、移植的免疫排斥反应很低，并且无伦理道德等问题，避免了直接注射腺相关病毒入体内，降低移植治疗的副作用和风险。因此，本发明的技术是先进的、安全可靠的。

本发明将干细胞技术与先进的基因载体治疗手段相结合，探索提高各项机能的新方法，为传统临床医学技术带来了革命性变化，具有重要的作用和深远的意义。

本发明利用hASCs具有的免疫原性低；具有多向分化能力；增殖能力强，生物学特性稳定；具有免疫调节功能，异体移植不引起免疫排斥反应；无伦理、道德及法律方面的限制；相对纯净，污染机会少等优势。

本发明利用腺相关病毒转基因快速、方便、安全的优点，将MT转入hASCs中过表达，将两种最新的治疗科技完美结合，进而输入人体，对多项机能有促进作用。

本发明开展MT-hASCs促多项机能临床试验，建立临床有效性安全性评价体系，获得MT-hASCs促机能方案和技术标准。

附图说明

图1所示为为实施例中hASCs培养状态（图1A为40X，图1B为100X）

图2所示为为实施例中hASCs成脂分化（图2A为200X，图2B为400X）

图3所示为为实施例中hASCs成骨分化（图3A为400X，图3B为400X）