[发明专利]一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及的是一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法。

背景技术

环境污染和遗传因素会导致DNA和基因的突变。癌细胞起源于人体内细胞由于DNA和基因突变的无控制生长。通常，癌细胞生长形成肿瘤，癌细胞还会转移到别处继续生长，从而破坏正常的组织器官，导致病人的死亡。据统计，目前癌症是继心血管之后的第二位导致人类死亡的因素，大约一半的男人和三分之一多的女人会产生癌症。《2012中国肿瘤登记年报》对外发布，报道全国每6分钟就有一人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每年新发癌症病例约350万，每七到八人中就有一人死于癌症，每年因癌症死亡约250万。

肿瘤的免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型生物技术治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。

利用特异的杀伤性淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗起源于八十年代，利用抗肿瘤的淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗是一种特异、有效而先进的癌症治疗手段。近年来，这一技术在皮肤癌晚期病人的治疗上得到成功的应用。临床试验证明，四分之三的皮肤癌晚期病人经过治疗后癌症肿块明显消退，一半的皮肤癌晚期病人完全康复。因此，利用抗肿瘤的淋巴细胞进行肿瘤细胞免疫治疗是一种非常有效的癌症治疗新技术，有着广阔的应用前景。

如果能早期判断肿瘤免疫治疗的效果，那对癌症病人的治疗有着极其重要的意义。研究表明，肿瘤免疫治疗的效果很大程度上取决于抗肿瘤淋巴细胞(主要是T淋巴细胞)在输入癌症患者后在病人体内的存活时间。也就是说，如果能够早期测定抗肿瘤淋巴细胞在癌症病人体内的存在状况，就可以早期判断肿瘤免疫治疗的效果。

T淋巴细胞在发育分化过程中，都会在细胞表面产生一种特定的受体，即T细胞受体。每一个T淋巴细胞克隆或每一种T淋巴细胞种群，都含有一种特异的T细胞受体。因此，如果能够测定T淋巴细胞上的T细胞受体，就可以正确判断特定的抗肿瘤淋巴细胞在癌症病人体内的存活状况。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在判定肿瘤免疫治疗效果中存在的不足，提供了一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法，其步骤如下：

(1)取五百万用于肿瘤免疫治疗的抗肿瘤淋巴细胞备用；在肿瘤免疫治疗之前、治疗后的7天、一个月和两个月，从癌症病人静脉抽取10毫升外周血，置于抗血凝的试管，4℃短暂保存；

(2)根据产品使用说明书，用淋巴细胞分离液从(1)所述外周血分离外周血单个核细胞；

(3)使用美国QIAGEN公司的RNeasy试剂盒和产品使用说明书，从五百万抗肿瘤淋巴细胞和外周血单个核细胞中提取总RNA；

(4)取每个样品100微克总RNA，使用美国CLONTECH公司的5’-RACE试剂盒和产品使用说明书，用5’-RACE CDS引物合成eDNA；

(5)将2.5微升cDNA产物与1毫摩尔dNTP底物、0.4微摩尔3’TCRBCN引物、一倍浓度扩增缓冲液和DNA聚合酶混合，在PCR扩增仪进行94℃30秒和72℃2分钟热循环5次，然后94℃30秒、65℃30秒和72℃2分钟热循环25次，最后在72℃保温10分钟，得到T细胞受体β链基因可变区段；

(6)使用美国Zymoclean公司的DNA凝胶回收试剂盒并根据产品说明书对T细胞受体β链基因可变区段进行DNA纯化；纯化后，使用美国Invitrogen公司的TA克隆试剂盒并根据产品说明书，将纯化后产物克隆到pcDNA3.1／TA载体；

(7)将克隆的载体通过化学转导法将其转化到TOP10感染态细菌细胞，在LB细菌平板培养基上37℃过夜培养16小时后形成单克隆细菌群落；

(8)挑选单克隆细菌群落，将一个细菌菌落转入1.5毫升LB液体培养基中，然后37℃震荡培养，转速为每分钟250转；液体培养15小时后，使用美国QIAGEN公司的质粒DNA分离试剂盒并根据产品说明书，从细菌中分离纯化质粒DNA；

(9)将从细菌中分离纯化的质粒DNA，用TCR-CB-50R引物对其进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定；或者将(7)所述单克隆细菌群落不经液体培养直接进行测序；