[发明专利]利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法。

背景技术

经过近30年的快速发展，对虾养殖业已成为我国农村经济的重要组成部分，在提高沿海地区农渔民就业和经济收入方面发挥了重要作用。但是，随着养殖规模的不断扩大和环境的恶化，对虾病害问题也日趋严重，病原种类繁多，而其中危害最严重的是对虾白斑综合征病毒(WSSV)。该病毒自1992年爆发以来，已在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失。仅1993至1994年，使我国的对虾养殖业大幅度减产，每年损失数十亿元。对虾白斑综合征的蔓延不仅使我国养虾业严重受伤，而且已在日本、泰国、越南、马来西亚、印度等国家和地区造成严重危害，使之成为世界性问题。1995年该病毒被国际兽疫局、联合国粮农组织以及亚太地区水产养殖发展网络中心列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。该病毒发病快、死亡率高、传播迅速，逐渐成为制约对虾养殖业发展的主要因素。目前，由于没有有效的药物来防治WSSV，因此控制对虾白斑综合征的方法主要在于选取优良品种、供给优质饵料、加强水质管理等措施。

中草药具有良好的抗病毒作用，可以直接抑制或灭活病毒，但对动物机体副作用小，且可以调节免疫功能，增强动物的抗病能力，具有良好的临床应用前景。并且，中草药在鱼虾等水生动物一些病毒性和细菌性疾病上取得了良好的防治效果。

然而，在养殖生产实践中中草药存在盲目使用的问题，未经过认真、科学的筛选，乱用药物的情况普遍存在。水产上用到的中草药配方多源自人类医学或通过活体生物试验法总结而得。迄今为止，水生动物中还没有通过细胞进行抗病毒药物筛选的报道。本技术方法，应用体外培养的对虾原代细胞进行抗WSSV中草药的筛选，具有快速和高通量筛选的特点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用对虾原代细胞筛选抗WSSV中草药的方法，筛选出具有抗病毒作用的单方或者复方中草药，解决目前在防治对虾白斑综合征病毒方面尚无全面有效治疗药物的现实问题，控制对虾WSSV蔓延的局面，为实现对虾健康养殖提供技术保障。

本发明所采取的技术方案是：

一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法，将纯化的对虾白斑综合征病毒与中草药相互作用，使中草药直接作用于对虾白斑综合征病毒，所述中草药作用后的对虾白斑综合征病毒接种体外培养的对虾原代细胞，，观察细胞的病理变化（CPE），从而筛选出具有抗对虾白斑综合征病毒作用的中草药种类。

进一步，所述的体外培养的对虾原代细胞是对虾类淋巴组织迁出的单层细胞，且淋巴组织是WSSV的易感组织。

进一步，在所述的中草药与WSSV相互作用之前，将纯化的对虾白斑综合征病毒粒子通过10倍梯度稀释，确定使细胞出现CPE的最低病毒浓度；设置不同浓度梯度的中草药药液，确定其作用于细胞的最大安全浓度。

进一步，所述的中草药直接作用于WSSV24-36h后，再把所述的中草药与WSSV的混合液接种体外培养的对虾原代细胞。

淋巴细胞感染WSSV24h后开始出现CPE，主要表现为细胞停止延伸，出现亮圆颗粒，贴壁细胞逐渐漂浮，细胞之间的网状结构消失，最后细胞破碎、溶解；有抗病毒作用的中草药能抑制WSSV对淋巴细胞的杀伤作用，细胞生长状态良好，细胞结构完整。根据以上原理，判断中草药是否具有抗WSSV的作用。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明以体外培养的对虾原代细胞为载体，不仅最大限度的模拟了动物体内的生理过程和环境，增加了筛选结果的真实性和准确性，使结果更接近临床效果。并且可以建立较大规模的中草药筛选模型，具有快速和高通量筛选的特点。

2、本发明与动物实验法相比，避免了对虾养殖的季节性，也不必浪费大量的实验对虾，操作方便，节约成本，大大提高了筛选的效率。换言之，本技术方法仅需要WSSV敏感的对虾组织，而不需要大量、昂贵的活体对虾进行实验。

3、本发明将中草药与病毒粒子混合后作用于对虾原代细胞，使中草药直接抑制或灭活病毒，避免了中草药直接作用于细胞产生的假阳性结果。

4、本发明可以直接通过倒置显微镜观察中草药对WSSV的药物作用和灭活病毒效果。

附图说明

图1.刀额新对虾淋巴组织原代细胞的光镜图片

A,B,C,D分别表示对虾淋巴组织原代细胞生长12h，24h，48h，72h

图2.纯化的WSSV经负染后的电镜图片

A.病毒核衣壳 B.完整的病毒粒子