[发明专利]一种测定细胞DNA损伤标志物*H2AX含量的酶联免疫测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞DNA损伤标志物磷酸化组蛋白（?H2AX）的酶联免疫检测技术，并将其用于卷烟烟气的基因毒性评估，具体是一种测定细胞DNA损伤标志物?H2AX含量的酶联免疫测定方法。

背景技术

DNA损伤有许多不同的形式，其中DNA双链断裂被认为是DNA最严重的损伤。当细胞发生DNA双链断裂后，组蛋白H2AX的丝氨酸残基可以被毛细血管共济失调突变基因（ATM）和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）等磷酸化，形成?H2AX。?H2AX的形成与双链断裂数量成正比，从而使?H2AX成为DNA双链断裂的重要的特异性生物标志物。近年来，有大量文献开展了卷烟烟气导致DNA双链断裂的研究。Albino等使用?H2AX来评价卷烟烟气对人类A549肺癌细胞和正常的人支气管上皮细胞基因毒性，发现呈剂量效应关系，进一步研究表明?H2AX与焦油含量正相关，而与卷烟类型和吸烟行为无关。Toyooka等研究证实卷烟主流和侧流烟气暴露于人类A549肺癌细胞，?H2AX呈剂量效应关系且与时间正相关。

目前?H2AX的检测方法主要有免疫荧光法、流式细胞技术和高内涵细胞成像技术。这些技术所需仪器昂贵，都是利用?H2AX的特异性抗体和荧光分子标记的二抗实现对目标物定量测定的，所用的荧光分子均为传统有机染料。本实验所采用的二抗为酶标抗体，目前应用较多的有辣根过氧化物（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等酶标记的抗体。

发明内容

本发明是基于现有技术状况而开发的细胞中DNA损伤标志物—?H2AX蛋白的酶联免疫检测方法，并利用该方法定量检测出由于卷烟烟气暴露而导致的细胞中?H2AX的含量变化，从而达到评价卷烟烟气基因毒性的目的。该检测方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等特点。

本发明的目的是通过以下具体步骤实现的：一种测定细胞DNA损伤标志物?H2AX含量的酶联免疫测定方法，是采用一种特异性?H2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白?H2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有荧光产物，可根据底物的荧光值实现对?H2AX定量测定的方法，具体步骤如下：

1)实验试剂的配制，包括以下实验试剂：（1）细胞培养基，（2）4%多聚甲醛溶液，（3）PBS-T缓冲液，（4）细胞膜通透液，（5）封闭剂，（6）混合一抗溶液，（7）混合二抗溶液，（8）底物A，（9）底物B；

2)细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，于37 ℃，5％C0₂培养箱中培养,细胞生长至汇合率为70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种,96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl细胞悬液，最终细胞接种密度为5000 个/孔,于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

3)卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备：卷烟样品于温度（22±1）℃和相对湿度60%±3%条件下平衡48 h；然后使用转盘式吸烟机在ISO抽吸条件下抽吸卷烟，烟气总粒相物用剑桥滤片收集，根据烟气总粒相物质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，使用前在－70 ℃以下储存；在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS溶液的吸收瓶中，粒相物收集完毕后，将PBS吸收液定容至与粒相物萃取液中DMSO体积相同，通过0.2 μm的滤膜除菌后，得到最终浓度与粒相物萃取液相当的烟气气相物吸收液，且必须在制备后半小时内使用。

4) 卷烟烟气染毒：使用细胞培养基将烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，分别设置7个不同浓度的烟气粒相物或烟气气相物染毒组和一个空白对照组，每组6个平行样孔，烟气粒相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，烟气气相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气气相物吸收液，空白对照每孔加入100 μl 稀释培养液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；