[发明专利]一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法。

背景技术

玉米（Zea mays L）是全世界总产量最高、分布最广的粮食作物之一，种植面积仅次于小麦（Triticum aestivum L）和水稻（Oryza sativa L）。我国玉米种植主要分布在北方和西南山区及其它旱谷地区，年产量居世界第二位。随着我国经济的发展，畜牧业，食品业，养殖业对玉米的需求逐年增长，致使玉米生产在国民经济中的作用日增，种植面积日趋扩大。但玉米生产面临诸多的制约因素，到目前为止，国内外已报道40多种危害玉米的病毒病。

玉米致死性坏死病（corn lethal necrosis，CLN）首先于1976年在美国堪萨斯州和内布拉斯加州的部分地区被发现，目前仅在这两个州的部分地区有报道。发病植株的叶片出现明显的黄绿相间的斑驳症状沿叶脉发展，慢慢从边缘开始出现坏死，直至整片枯死，因此命名为致死性坏死病。发病植株易矮化，果穗较小、常畸形，籽粒少，甚至不结籽，造成严重减产。玉米的任何一个生长期都对CLN敏感，早期被感染的植株常败育，后期被侵染的植株不易出现黄绿斑驳的叶部症状，主要表现为果穗结实率不高。目前多数品种对CLN没有抗性，无药剂可防治，因此一旦发生将会对生产带来毁灭性打击。

CLN是由两种病毒混合侵染引起的——玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus，MCMV）与甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）共同侵染。当其中一种病毒单独侵染都只出现浅绿色的斑驳，且对产量影响较小。SCMV是一种世界性分布的病毒，可由蚜虫传播，在我国的玉米产区广泛发生。MCMV分布在美国、秘鲁、墨西哥和巴西，可通过西花蓟马和种子携带传播。MCMV是一种新的外来入侵危险性有害生物，除云南外国内尚未发现该病毒和危害，对它的研究几乎为空白。

种子健康检测是控制种传性病毒病害的第一道防线，也是防止种传性病毒病害传入最有效的措施，因此检测的准确性和方便性是种子健康性检测工作的核心因素。同时，田间病害调查中在早期发现染病植株并及时根除是阻止病毒病害扩散的重要措施之一。因此一个快速有效的检测方法对病毒病害的防治极为重要。目前在病毒检测中常用的检测方法主要是血清学检测和分子生物学检测两大类。血清学检测方法操作较简单、成本低，缺点是灵敏度较低，对于种子等繁殖材料中病毒含量较低时容易出现假阴性的结果。分子生物学检测方法根据原理不同，分为PCR检测、实时荧光PCR、分子杂交等几类，其中PCR技术是使用最为广泛的一种，其成本较血清学检测方法略高，但是其灵敏度大为提高，这样对健康检测是十分必要的。玉米致死性坏死病是一种由两个病毒混合侵染引起的重要病害，目前现有报道的方法都是单独针对每一种病毒进行检测，如闻伟刚等人发表的“玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究”和李利君等人发表了“利用斑点杂交法和RT-PCR技术检测甘蔗花叶病毒”，两个病毒的检测需要分开进行。

目前除本发明以外，无任何文献报道在一个反应管中可以同时检测玉米致死性坏死病的两种致病病毒。

发明内容

本发明的目的是针对玉米致死性坏死病的检测需求，提供一种可以快速、准确检测该病害的两种病原病毒的分子生物学检测方法，以简化操作、减少工作量、提高效率，填补相关方法缺失的空白，满足实际种子健康检测和病害调查的需求。

本发明的一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法的建立具体包括下列步骤：

一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法，本发明包括如下步骤：

1）样品RNA提取：对待测样品进行RNA提取；

2）对样品的总RNA进行反转录反应；

3）用甘蔗花叶病毒和玉米褪绿斑驳病毒的特异性引物同时进行双重聚合酶链式反应；特异性引物为：SCMV1F、SCMV2R、MCMV3333F和MCMV4173R；引物序列分别为：SCMV1F，YGAHGCCATAAAGAAGGAGTAYG；SCMV2R，GTGTGTCTCTCTGTATTCTCCTG；

MCMV3333F，GGTGTACTCGATCGATCAGAC；MCMV4173R，

AAACACTTTGGATTGGCAGGAC；

4）对PCR反应的产物进行电泳检测，可以采用1%的琼脂糖胶进行电泳实验并拍照、分析；

5）判断样品是否携带这两种病毒。