[发明专利]L-苯丙氨酸高产菌株及其在发酵生产L-苯丙氨酸中的应用

权利要求书

1.一种L-苯丙氨酸高产菌株，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）BT-N0086，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO.M2013484。

2.根据权利要求1所述的L-苯丙氨酸高产菌株的诱变方法，其特征在于具体步骤如下：

(a)、样品悬浮液制备：从在固体培养基中的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum培养物中获得待诱变的细胞混悬液：将谷氨酸棒杆菌出发菌株制成镜检无细胞重叠的细胞混悬液；

(b)、亚硝基胍NMMG诱变：在20℃和100rpm下，将10⁸细胞／ml步骤（a）的细胞混悬液加入到含有300～500mg／ml亚硝基胍MNNG溶液的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液，在pH5.0的环境下中温浴60～120min，然后将诱变细胞在液体培养基中，26～30℃、100rpm的环境下下培养10小时，得到诱变后的菌液；

(c)、诱变菌株的筛选：将步骤(b)诱变后菌液涂在固体培养基上进行分离，然后将固体培养基上的单菌落接入种子培养基，在培养温度31～33℃，240～320rpm摇床转速下扩大培养12～24h后，按5～15%v/v的接种量接入发酵培养基；然后在31～33℃、240～320rpm摇床转速下发酵24～44h后下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中L-苯丙氨酸含量；取发酵液L-苯丙氨酸含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a)～(c)，直至筛选出L-苯丙氨酸产量高的目标菌株谷氨酸棒杆菌C.glutamicum BT-N5086。

3.根据权利要求2所述的L-苯丙氨酸高产菌株的诱变方法，其特征在于：步骤(b)中亚硝基胍NMMG优选诱变剂量为400mg／ml；步骤(b)中所用的固体培养基为：碳源2.0%～4.0%、氮源0.5%～1.5%、其余为水，pH7.0～7.2；其中所述碳源为淀粉水解糖和糖蜜中的一种或两种的混合；所述氮源为牛肉膏和酵母粉中的一种或两种的混合。

4.根据权利要求2所述的L-苯丙氨酸高产菌株的诱变方法，其特征在于：步骤(c)中所用的固体培养基为：碳源2.0%～4.0%、氮源0.5%～1.5%、其余为水，pH7.0～7.2；其中所述碳源为淀粉水解糖和糖蜜中的一种或两种的混合；所述氮源为牛肉膏和酵母粉中的一种或两种的混合；步骤(c)中所用的种子培养基为：碳源3.0%～5.0%、氮源1.0%～3.0%、无机盐0.1%～0.4%，其余为水，pH7.0～7.2；其中所述碳源为淀粉水解糖和糖蜜中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、黄豆饼粉中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合；步骤(c)中所用的发酵培养基为：碳源1.0%～3.0%、氮源2.0%～6.0%、无机盐0.1%～0.4%、微量元素0.0001%～0.0004%，其余为水，pH7.0～7.2；其中所述碳源为淀粉水解糖、糖蜜中的一种或两种的混合；所述氮源为尿素、黄豆饼粉中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合；所述的微量元素为维生素B1。

5.权利要求1所述的L-苯丙氨酸高产菌株在发酵生产L-苯丙氨酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的L-苯丙氨酸高产菌株在发酵生产L-苯丙氨酸中的应用，其特征在于：所述的发酵生产L-苯丙氨酸的方法包含如下步骤：

(1)、固体培养：将谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)BT-N5086接种于固体培养基上，培养温度为31～33℃，培养时间为12～24h；

(2)、种子培养：将步骤(1)固体培养的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)BT-N5086接种到种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为20～50mL，培养温度为31～33℃，240～320rpm摇床转速下培养24～44h；

(3)、发酵培养：将步骤(2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5～15%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为35～65mL，培养温度为31～33℃，240～320rpm摇床转速下培养24～44h。