[发明专利]I型登革病毒KMB17细胞适应株的培育及其制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种病毒株的制备方法，具体涉及I型登革病毒在KMB17细胞上的适应株的分离、筛选、选育、纯化以及培养方法，属于病毒疫苗制造技术领域。

背景技术

登革病毒经埃及伊蚊和白纹伊蚊等虫媒传播，广泛流行于热带和亚热带国家及地区，可引起登革热、登革出血热及登革出血休克征。依抗原性不同可将登革病毒分为Ⅰ、I、Ⅲ、Ⅳ四个血清型。近年来，由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素，登革热在全世界的发病率提高了近30倍，在过去两年中全球登革热感染人群的数量持续增长。登革热是过去50年间世界上最为严重的传染病之一，已经成为严重的全球公共卫生问题。登革热不仅严重危害人民的健康，而且还为国家和个人带来严重的经济负担。由于还没有可供使用的登革热疫苗用于预防，登革热的防控形式日趋严峻，因此登革热疫苗相关的应用基础研究是一项迫在眉睫的任务。但是由于登革热病毒宿主细胞局限的，所以迄今为止全球仍没有获准上市的登革病毒疫苗，因此登革疫苗研发迫在眉睫。目前最有潜力的传统减毒活疫苗候选株是由泰国沃特瑞德研究所研发的以犬肾细胞和恒河猴胚肺细胞为基质的疫苗，Vero细胞也被认为是疫苗开发的候选基质，以人源性细胞制备的登革疫苗候选株还未见报道。因此研究登革病毒在人源性细胞上的适应性对于登革病毒疫苗的研发具有重要意义。

现有的灭活和减毒活疫苗，主要以Vero、PDK、PGMK和FrhL等非人源性细胞为基质进行生产的，其残余DNA存在潜在的致病危险，目前普遍认为比较安全且免疫效果好的，仍然是用人源性细胞基质（如KMB17细胞）生产的疫苗，自从Hayflick等首次建立二倍体细胞株后,近三十多年来,人二倍体细胞的研究在国际上有很大的发展,在病毒学,细胞学,遗传学,肿瘤学等方面研究工作中已被广泛的应用,尤其在生产病毒疫苗等方面,提供了安全、实用的良好细胞。而以人源性细胞基质制备的登革疫苗候选株目前尚未见报道。因此，研究登革热病毒在人源性细胞上的适应性，对于登革疫苗的研发具有重要意义。

人胚肺二倍体细胞系KMB17为中国医学科学院医学生物学研究所建立、可用于疫苗生产的人源细胞。人胚肺二倍体细胞KMB17用于人用疫苗具有很多优点: 无致癌性，且安全性高于其它细胞，易于规模化生产，而且对多种病毒具有广泛的敏感性， 用其制备病毒性疫苗，还可克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险，作为人源性细胞基质生产人用疫苗时，引入的外源因子较少，比动物来源的细胞基质具有更好的安全性，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质，且能稳定实现大规模疫苗生产。人胚肺二倍体细胞KMB17，已经成功应用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗的生产，其安全性和细胞稳定性都得到了广泛验证，但目前还没有成功应用于I型登革病毒中国株的报导。

本专利技术将近年来流行于我国的Ⅰ型登革病毒分离株在C6/36细胞上进行扩增和鉴定，随后在KMB17细胞上进行适应性培养，优化及建立了Ⅰ型登革病毒在KMB17细胞上培养方法。选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的细胞适应株，经噬斑纯化获得毒力较强、纯度较高的纯化株，经鉴定病毒纯化株保持了原始毒株的基本生物学特性，且具有较好的抗原性。通过本专利技术可以证实以KMB17细胞为基质进行登革病毒扩增和疫苗研究具有可行性，打破了登革病毒宿主细胞的单一性、局限性，具备大规模生产的可行性，为研发具有我国地域特色的预防性登革病毒疫苗开拓新的思路，为研发拥有自主知识产权的登革病毒灭活和减毒活疫苗奠定基础，此疫苗的研发将产生巨大的经济价值和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种I型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，为将人胚肺二倍体细胞KMB17应用于I型登革病毒疫苗的生产提供技术支持。

本发明提供的I型登革病毒KMB17细胞适应株通过下列步骤获得：