[发明专利]一种非病毒转基因载体、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种非病毒转基因载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗通过将目的基因导入到靶细胞核内以修复或置换导致疾病的缺陷基因，为先天和后天的基因缺陷疾病提供了新的治疗方法，寻求合适的转基因载体将目的基因导入到靶细胞内无疑成为基因治疗成功与否的关键所在。

目前，转基因载体主要有非病毒载体，非病毒载体主要包括壳聚糖、脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和树枝状高聚物(Dendrimer)等，这些非病毒载体通过静电作用与DNA复合形成纳米微球进行基因转染。其中，壳聚糖(Chitosan)作为唯一的天然阳离子多糖，具有良好的生物相容性、低细胞毒性和可降解性等优点，因而广泛地应用于非病毒转基因载体。但壳聚糖作为非病毒转基因载体时转染效率较低，成为制约其在实际临床应用中的瓶颈，因此，如何提高非病毒转基因载体的转染效率成为研究重点。

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面旨在提供一种非病毒转基因载体，该非病毒转基因载体转染效率良好；本发明第二方面旨在提供一种非病毒转基因载体的制备方法，该制备方法简单，制备的非病毒转基因载体转染效率良好；本发明第三方面旨在提供一种用于基因治疗的纳米复合物，该纳米复合物的转染效率良好；本发明第四方面旨在提供一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，该纳米复合物的制备方法简单，制备得到的用于基因治疗的纳米复合物细胞转染效率良好。

第一方面本发明提供了一种非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

优选地，所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

优选地，所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

现有技术中，精氨酸短肽是一种穿膜肽，在生理条件下精氨酸短肽带有大量的正电荷，能够快速与带负电荷的细胞膜上的磷脂分子作用，启动细胞膜外物质的跨膜传输，从而将细胞膜外物质导入细胞内，且不损伤细胞膜的结构和功能，具有较强的细胞膜穿透能力，转运效率高。因此被广泛用于传递各种蛋白、大分子和纳米粒子进入细胞。

本发明提供了一种非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述非病毒转基因载体上的精氨酸短肽单元可以与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进所述非病毒转基因载体进入细胞质，转染效率高。

第二方面本发明提供了一种非病毒转基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）提供精氨酸短肽；将所述精氨酸短肽和活化剂溶解于缓冲液中得到精氨酸短肽溶液；

（2）将壳聚糖溶解后得到壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴加到所述精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应1～6天，所述混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，得到产物，将所述产物分离纯化后进行冷冻干燥，得到所述非病毒转基因载体；所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

优选地，步骤（1）中所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

优选地，步骤（1）中所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的至少一种。

优选地，步骤（2）中所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

优选地，所述精氨酸短肽和所述壳聚糖的摩尔比为1:1～1:20。

所述壳聚糖和精氨酸短肽通过酰胺化反应一步合成所述非病毒转基因载体，制备方法简单，原料廉价易得，制得的非病毒转基因载体中的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进所述非病毒转基因载体进入细胞内，转染效率高。

第三方面，本发明提供了一种用于基因治疗的纳米复合物，所述纳米复合物为质粒DNA和上述所述的非病毒转基因载体通过静电作用形成的纳米微球。

所述精氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，将具有穿膜作用的精氨酸短肽连接到壳聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体能够有效复合DNA形成纳米复合物，所述纳米复合物上的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，促进纳米复合物进入细胞内，实现了目的基因的投递，有利于目的基因后续的表达。

第四方面，本发明提供了一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：